4種黃連生物堿的抑菌作用

【摘要】  　　目的小檗堿，藥根堿，黃連堿和巴馬亭是黃連中4種主要的生物堿，為深入研究4種黃連生物堿成分的抑菌特性差異，本實驗對它們的抑菌譜和抑菌活性進行了實驗研究。方法以從石柱黃連中提取的4種生物堿為實驗藥物，采用抑菌圈實驗法，在2 000 μg/mL藥液濃度下對常見的19種微生物進行了藥物敏感性試驗,並通過比濁法對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）進行了檢測。結果4種生物堿成分的敏感菌範圍相同但抑菌活性不同，其中小檗堿的抑菌活性最大,黃連堿和巴馬亭次之，藥根堿最小；4種黃連生物堿對革蘭氏陽性菌的抑製活性大於革蘭氏陰性菌和酵母菌；每種生物堿對耐藥金葡菌（MR）和金葡菌的抑菌能力基本相同。結論4種黃連生物堿均為黃連的抗菌活性成分，抑菌譜相同，但抑菌活性有較大差異；4種黃連生物堿對耐藥金葡菌的耐藥性具有消除作用。

【關鍵詞】  黃連 小檗堿 藥根堿 巴馬亭 黃連堿 抑菌

　　Abstract:ObjectiveBerberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine are four leading alkaloids from Coptidis rhizome. To research the characteristics of antimicrobial activity of above alkaloids, the antimicrobial spectrums and abilities of them were determined in this paper.MethodsSensitivities of 19 microorganisms to berberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine were studied under medicine concentration of 2 000μg/ml by antimicrobial circle experiment and their Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) against 14 sensitive microorganisms were determined by colorimetry in this study. ResultsFour alkaloids from Coptidis rhizome had the same antimicrobial spectrums and different antimicrobial abilities, the antimicrobial activity of berberine was the strongest, coptisine and palmatine was relatively weak and jatrorrhizine was the worst. The antimicrobial abilities of four alkaloids against G+ bacterium were stronger than against G－ bacterium and fungus. The same activity of four alkaloids against Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus aureus were observed.ConclusionAll alkaloids tested are antimicrobial activity ingredient of Coptidis rhizome. Four alkaloids almost have the same antimicrobial spectums and have different antimicrobial abilities. All alkaloids tested can dispose the drug resistance of Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA).

　　Key wordsCoptidis rhizome;   Berberine;   Jatrorrhizine;   Palmatine;   Coptisine;   Antimicrobial activity

　　黃連是中醫臨床上的常見抗菌消炎中藥，在臨床上除主要用於治療菌痢、腸炎、腹瀉、胃炎等細菌性胃腸炎疾病。研究表明，黃連中的抗菌消炎的物質基礎主要是其中所含的原小檗堿類生物堿成分，而小檗堿，藥根堿，黃連堿和巴馬亭是黃連中4種主要的生物堿成分，在分子結構特點上均屬異喹啉類生物堿,具季銨基團［1］。為深入研究黃連中不同生物堿成分的抑菌活性差異和拓展黃連生物堿的應用領域，從石柱黃連中提取了小檗堿、藥根堿、黃連堿和巴馬亭，以常見的19種動植物病原菌為實驗菌進行藥物敏感性實驗並對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）進行檢測，以期為擴展小檗堿和其它黃連生物堿的應用範圍和臨床用藥提供科學依據。

　　1  器材

　　實驗藥物：小檗堿、藥根堿、黃連堿和巴馬亭（由實驗室從石柱黃連中提取分離製備，HPLC檢測純度均在97%以上）。實驗菌株：金黃色葡萄球菌 (ATCC25923)，金黃色葡萄球菌耐藥菌（MR），膿腫分枝杆菌，傷寒杆菌，綠膿杆菌，誌賀氏痢疾杆菌，克雷伯氏菌，腸炎沙門菌，巨大芽孢杆菌，枯草杆菌，大腸杆菌變形杆菌，白色葡萄球菌，假絲酵母，白色念珠菌，四聯球菌，魚害粘球菌和魚腸型點狀產氣單胞菌（實驗菌株由重慶醫科大學基礎醫學院病原微生物教研室和西南大學資源與環境科學學院微生物教研室提供）。

　　培養基：真菌采用改良沙保氏培養基（配方為：蛋白腖10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml），魚病原菌（鮭腎杆菌，魚害粘球菌和魚腸型點狀產氣單胞菌）采用胰蛋白腖醋酸鈉培養基（配方：胰蛋白腖5.0 g， 醋酸鈉2.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏0.2 g，蒸餾水1 000 ml），其它細菌采用普通細菌培養基加減成分進行培養。配製時固體培養基加入1.5%的瓊脂，液體培養基不加。

　　實驗設備：96微孔板，酶標儀，超淨工作台，滅菌鍋，恒溫培養箱。

　　2  方法

　　2.1  微生物敏感性實驗將備選的菌種采用較高濃度的藥液進行藥物敏感實驗，初步確定3種生物堿對實驗菌的抑菌作用，為進一步研究藥物對敏感菌的抑菌能力提供依據。

　　方法為：①藥液配製及紙片製備：將每種藥液均配製成濃度為2.0 mg/ml的溶液，將直徑6.35 mm的紙片浸泡於藥液，100℃/30  min滅菌，冷卻後置冰箱保存。②菌液製備：將實驗菌種先接種到斜麵活化培養24 h, 膿腫分枝杆菌培養2 d後用滅菌生理鹽水洗下，計數後用液體培養基配成108 cfu/ml的菌液。③抑菌圈試驗：用滅菌後的塗布環將試驗菌液均勻塗抹於固體瓊脂平板上，每個平板放上3個藥物紙片，膿腫分枝杆菌培養2 d，其它實驗菌培養24 h後觀察，記錄抑菌環直經。

　　2.2  敏感菌的MIC定量實驗對3種藥液進行藥物敏感性實驗以後，挑選敏感的菌種，采用液體培養基連續稀釋法培養後檢測每種黃連生物堿對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512和1∶1024共11個濃度。②實驗操作在96微孔板上進行，每試驗微孔用移液槍加入液體培養基100 μl，試驗菌液20 μl，藥液120 μl，混勻後置37℃培養，膿腫分枝杆菌培養2 d，其它實驗菌培養24 h後觀察。每個實驗3個重複並設立不加實驗菌的本底對照（120 μl藥液＋120 μl液體培養基）。③采用酶標儀檢測微孔板實驗菌的生長情況，檢測指標為微孔中培養液體係的光密度（OD值），檢測波長620 nm。實驗微孔的OD值減去同濃度的本底對照的OD值即為實驗微孔的OD淨值。根據OD淨值判定藥物對該實驗菌的MIC。

　　3  結果與討論

　　3.1  藥物敏感性實驗表1為黃連中4種生物堿對常見19種微生物藥物敏感性試驗的觀察結果，從表中可以看出，4種黃連生物堿的敏感菌菌譜除了藥根堿以外其它3種基本相同，從表中數據不難發現，黃連生物堿類對G+菌比對G－菌和真菌的作用更加明顯。表1  黃連生物堿對19種病原菌的藥敏實驗 （略）

　　3.2  黃連生物堿敏感菌的MIC測定表2為4種黃連生物堿在2 000 μg/ml濃度紙片法條件下篩選出的14種敏感菌的MIC測定結果，從表中數據可知：4種生物堿對同種敏感菌的抑菌能力有一定的差異，總體分析來看，小檗堿的抑菌作用和抑菌譜似乎更大一些，黃連堿和巴馬亭次之，藥根堿最弱。由於藥物的難溶性而限製進一步提高藥物濃度，在表麵看來是抑菌譜的差異實際上可能是抑菌能力的差異。同時在試驗中還觀察到4種生物堿對耐藥金黃色葡萄球菌有較強的抑製作用，小檗堿，黃連堿和巴馬亭對膿腫分枝杆菌具有一定的抑製作用。表2  4種黃連生物堿對敏感菌的MICμg·ml-1（略）

　　小檗堿，黃連堿，巴馬亭和藥根堿是黃連中含量最為豐富的4種生物堿，4種生物堿具有相同的基本分子骨架即原小檗堿類生物堿分子骨架和芳型季銨氮結構，4種生物堿均具有相同的異喹啉基本分子骨架，抑菌譜理論上不會產生較大差異。而Iwasa等［2］報道原小檗堿類生物堿的藥效必需結構為7位的芳環季銨氮結構，4種生物堿在分子結構上的區別在於A環2，3位取代基團和D環9，10位的取代基團的不同，而在A環和D環取代基團不同對原小檗堿類化合物的抑菌活性會有增減作用。

   

　　張傳美等［3］發現黃連複方三黃湯或黃連小檗堿對慶大黴素大腸杆菌具有很好的抑製活性，認為它們能抑製和消除耐藥菌株的抗藥性。本實驗中4種黃連生物堿對金葡菌和耐藥金葡菌（MR）的MIC基本相同，進一步證明了黃連生物堿對耐藥菌株有較好的抑製作用，就此現象進行研究具有很高的醫學價值。

對原小檗堿類化合物藥理作用的深入研究後發現，該類化合物除了具有較強的抗菌消炎作用外，而且還具有降血脂，降血糖，抗腫瘤和抗瘧疾等藥理作用［3～5］。因此，對原小檗堿類生物堿藥物化學的深入研究具有較高的科研價值。

作者：楊勇 葉小利 李學  《時珍國醫國藥》

  　　［1］Ji Y B. The pharmacology and application of the active component of chinese herbs［M］. Harbin: Heilongjiang technological press , 1995：691.

　　［2］K Iwasa, M Kamigauchi, M Ueki, et al. Antibacterial activity and structure-activity relationships of berberine analogs［J］. Eur J Med Chem , 1996, 31: 469.

　　［3］Zhang C M, Liu N B ,Yu M, et al. Inhibition of Compounding of Gentamycin , Sanhuangtang and Berberine to E. coli in Vitro［J］.J Laiyang Agri Co, 2004，21 (1) : 14.

　　［4］Wei J, Jiang J D, Wu J D, et al. Research on the effective improvement of hyperlipidemia by berberine［J］.Chin J Diabetes, 2005 , 13(1): 49.

 

［5］Yin J, Hu R M, Tang J F, et al. Glucose-lowering effect of berberine in vitro［J］.Acta Univ Med Second Shanghai, 2001, 21(5) : 4252.