綿毛鹿茸草的次生代謝產物含量與抑菌活性分析

【摘要】  ［目的］綿毛鹿茸草的次生代謝產物含量與抑菌活性分析。［方法］對綿毛鹿茸草不同提取液的總黃酮、總綠原酸、總生物堿、總皂甙、遊離蒽醌等次生代謝產物含量和抑菌活性進行測定。［結果］顯示：70%乙醇提取液、60%丙酮提取液對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌有中等抑製作用，水提取液有弱抑製作用；70%乙醇提取液是肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌的良好抑製劑，60%丙酮提取液是大腸杆菌、枯草芽孢杆菌的良好抑製劑。［結論］綿毛鹿茸草提取掖對大腸杆菌的抑菌活性與綠原酸的含量具有顯著的正性關，對枯草芽孢杆菌的抑菌活性與蒽醌之間存在極顯著的相關性。

【關鍵詞】  綿毛鹿茸草；次生代謝；抑菌活性

　　Abstract：［Objective］To analyse the content of secondary metabolisms and antibacterial activity of Monochasma Savatieri Franch.ex Maxim.［Method］The contents of 5 secondary metabolites such as flavonoid，chlorogenic acid，tannin，phenol and anthraquinones in the different extracts of Monochasma savatieri Franch.ex Maxim were determined.［Results］It showed that the antibacterial activity of the liquids extracted with 70% ethanol，60% acetone on Streptococcus pneuoncae，Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus subtilis were moderate，while that of the liquids extracted with water was weak.The liquids extracted with 70 ethanol were the better inhibitor of Streptococcus pneuoncae and Staphylococcus aureus，while the liquids extracted with 60 acetone were the better inhibitor of Escherichia coli and Bacillus subtilis.［Conclusion］There was positive correlation between the antibacterial activity of the liquids of Monochasma savatieri Franch.ex Maxim on Escherichia coli and the content of the chologenic acid.There was also marked correlation between that of Baillus subtilis and anthra quinones.

　　Key words：monochasma Savatieri Franch.ex Maxim；secondary metabolism；antibacterial activity

　　綿毛鹿茸草 (Monochasma savatieri Franch.ex Maxim)為唇形科鹿茸草屬植物，別名白頭翁、千重塔、白頭毛，分布於浙江、福建、江西，常生於山坡向陽處雜草中或馬尾鬆林下［1］。主要功能為清熱解毒，祛風行氣，涼血止血，祛痰，用於感冒，慢性氣管炎，肺炎，咳血，吐血，便血，牙齦炎，牙髓炎，乳癰，癰腫，小兒口瘡，風濕關節痛等。本文對綿毛鹿茸草的不同提取液中總黃酮、總綠原酸、總生物堿、總皂甙及其對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌活性進行研究，並探討這五類次生代謝產物與抑菌活性之間的相互關係。

　　1  實驗與方法

　　1.1  實驗材料和儀器  綿毛鹿茸草於2007年6月采自浙江千島湖姥山林場的山坡上。采集時將棉毛鹿茸草全草用濕布包裹，塑料袋封裝，立即帶回實驗室。將材料洗淨，防入105℃恒溫幹燥箱中固定25min，再在80℃條件下幹燥24h，研磨後經過0.25mm金屬網篩，將烘幹樣品放入磨口廣口瓶，置於幹燥器中保存，備用［2］。標準品蘆丁、綠原酸、小蘖堿、人參皂甙Rb，1，8二羥基蒽醌購自中國藥品生物製品檢定所，所用試劑均為分析純。四種菌種均由浙江台州醫院無償贈送。培養基為牛肉膏培養基。吸光度的測定在T6新世紀紫外-可見分光光度計上完成。

　　1.2  綿毛鹿茸草提取液的製備  稱取綿毛鹿茸草粉末3份，每份1g，其中2份分別用70%乙醇、60%丙酮在80℃水浴中回流6h，進行提取，離心取上清液，並清洗殘渣2次，離心取上清液，將3次上清液合並；另1份用沸水進行提取0.5h，離心取上清液，反複多次，直至提取液色淡，並將幾次沸水提取液混合。將乙醇、丙酮、沸水提取液的濃縮，並調節pH至7.0，然後用蒸餾水定容至1ml，放入4℃的冰箱中待用。

　　1.3  次生代謝產物含量的測定

　　1.3.1  總黃酮的提取與測定［3］  取上述綿毛鹿茸草提取液樣品0.2ml，揮去溶劑後用甲醇定容至25ml，取其中1ml，置10ml離心管中，加入4ml 0.1mol/L三氯化鋁-甲醇溶液，搖勻，在420nm處測定吸光度。以蘆丁為標準品，其回歸方程為y=9.6101x+0.0147，R2=0.9991。

　　1.3.2  總綠原酸的提取與測定［4］  取上述綿毛鹿茸草提取液樣品0.2ml，揮去溶劑後用95%乙醇定容至25ml，取1ml，置25ml容量瓶中，加入0.2mol/LHCl定容至刻度，搖勻，以試劑空白為對照，在324nm處測定吸光度。以綠原酸為標準品，其回歸方程為y=66.064x+0.0134，R2=0.9995。

　　1.3.3  總生物堿的抽提與測定［5］  取上述綿毛鹿茸草提取液樣品0.2ml，揮去溶劑後用90%乙醇定容至25ml。取提取液1.4ml置於精密加入4ml氯仿的分液漏鬥中，加入7.2×10-4mol/L溴甲酚綠pH=4.42緩衝溶液0.6ml，振搖1min，靜置1h，取澄清的氯仿液，以試劑空白作對照，於417nm處測定吸收度。以小檗堿為標準品，其回歸方程為y=6.6x-0.0102，R2=0.9999。

　　1.3.4  總皂甙的提取與測定［6］  取上述綿毛鹿茸草提取液樣品0.2ml，揮去溶劑後用甲醇定容至25ml，取1ml置25ml容量瓶中，揮去溶劑後，加入0.2ml 5%香草醛冰醋酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，於70℃水浴加熱20min，取出，冷卻，加5ml冰醋酸，以試劑空白作對照，於560nm波長處測其吸光度。以人參皂甙Rb為標準品，其回歸方程為y=27.763x+0.0901，R2=0.9716。

　　1.3.5  遊離蒽醌的提取與測定［7］  取上述綿毛鹿茸草提取液樣品0.2ml，放入10ml離心管中，水浴蒸幹溶劑，加入5%醋酸鎂乙醇溶液5ml，以試劑空白為對照，在498nm處測定吸光度。以1，8二羥基蒽醌為標準品，其回歸方程為y=47.464x+0.0012，R2=0.9996。

　　1.4  抑菌活性的研究  以濾紙瓊脂擴散法測定綿毛鹿茸草三種溶劑提取物對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果。將經過記數的菌液稀釋後，控製100μL含104cfu，塗平板。將滅菌後濾紙片（直徑為6mm）浸泡在棉毛鹿茸草提取液中。在已塗菌的平板上放置上述濾紙片，並以蒸餾水為陰性，鏈黴素為陽性對照，每一樣品重複3次。處理後的平板放在30℃培養24h，觀察並記錄抑菌圈的直徑大小［8］。

　　1.5  數據的處理  試驗處理及數據測定均重複3次，將所得數據輸入SPSS11.5for Windows數據分析係統進行統計，並對次生代謝產物的含量與抑菌圈的大小進行相關分析。

　　2  結果與分析

　　綿毛鹿茸草不同提取液次生代謝產物含量以及它們對四種細菌的抑菌圈大小如表1所示。其中次生代謝產物的含量為百分含量，抑菌活性以抑菌圈的大小（mm）表示，陰性對照抑菌圈直徑6mm，陽性對照（鏈黴素）抑菌圈26mm；抑菌圈直徑在6～8mm為微弱抑菌，8～12mm為弱抑菌，12～20mm為中等抑菌，20～24mm為強抑菌。綿毛鹿茸草的的次生代謝產物和抑菌圈直徑的相關性如表2所示。

表1  綿毛鹿茸草提取液次生代謝產物的含量（g/kg）及其抑菌圈直徑（略）

　　2.1  綿毛鹿茸草提取液次生代謝產物含量和抑菌活性分析  從表1中可以看出：總黃酮、總綠原酸、遊離蒽醌三種次生代謝產物的含量均為70%乙醇提取液>60%丙酮提取液>水提取液，最高含量分別為1.403g/kg、72.752g/kg、0.043g/kg；生物堿和皂甙的含量為60%丙酮提取液>70%乙醇提取液>水提取液，最高含量為1.677g/kg和5.418g/kg。

　　對進肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌的抑製作用均是60%丙酮提取液>70乙醇提取液>水提取液，最大抑菌圈直徑為15.47mm和17.40mm，為中等抑菌作用；對大腸杆菌和枯草杆菌的抑製作用是70乙醇提取液>60%丙酮提取液>水提取液，最大抑菌圈直徑為19.03mm和14.83mm，為中等抑菌作用。水提取液對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直徑均在9～12mm之間，具有弱抑菌作用。可以看出綿毛鹿茸草的70%乙醇提取液和60%丙酮提取液是良好的抑菌劑。

　　2.2  不同提取液的次生代謝產物含量與抑菌活性的相關性分析  從表2可以看出：黃酮與蒽醌之間存在顯著的正相關，推測綿毛鹿茸草中這兩種次生代謝產物可能具有相同的合成底物或具有相同代謝途徑；大腸杆菌的抑菌活性與綠原酸的含量具有顯著的正性關，推測綿毛鹿茸草對大腸杆菌的抑製作用可能是提取液中的綠原酸起的作用；蒽醌與枯草芽孢杆菌之間存在極顯著的相關性，說明綿毛鹿茸草對枯草芽孢杆菌的抑製作用主要是蒽醌作用的結果；肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌之間具有顯著的相關性，而與所測的5種次生代謝產物之間都沒有顯著相關性，因此推測綿毛鹿茸草中其它某些物質對肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑製作用。

　　表2  綿毛鹿茸草不同提取液的次生代謝產物含量與抑菌活性的相關性（略）

　　水平顯著差異：*P<0.05，**P<0.01

3  討論   

　　次生代謝是植物的重要特征，其產物既具有重要的生態學意義又可決定各類植物在進化過程中的興衰成敗、生死存亡等問題［9］，植物中的次生代謝產物還具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種活性。

　　綿毛鹿茸草對70%乙醇提取液、60%丙酮提取液、水提取液對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑製作用，前兩者為中等抑製作用，後者為弱抑製作用；70%乙醇提取液是肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌的良好抑製劑，60%丙酮提取液是大腸杆菌、枯草芽孢杆菌的良好抑製劑。推測對大腸杆菌和枯草杆菌的抑製作用主要由提取液中的綠原酸和蒽醌引起的。

　　文獻查閱得知：金銀花中綠原酸的平均含量為56.92g·kg-1［10］，巴戟天樣品的遊離蒽醌含量為的範圍為0.013～0.049g·kg-1［7］。綿毛鹿茸草70%乙醇提取液中總綠原酸、遊離蒽醌的含量72.752g·kg-1、0.043g·kg-1。從中不難看出：70%乙醇提取液是綿毛鹿茸草的良好提取劑。至於綿毛鹿茸草中這些次生代謝產物的分子組成、分子結構等方麵內容有待進一步的研究。

作者：楊蓓芬 崔敏燕《浙江中醫藥大學學報》

【參考文獻】

  　　［1］ 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第四冊)［M］.北京：科學出版社，1987：97.

　　［2］ 何維明，鍾章成.絞股監種群次生代謝產物的動態及其生態學意義［J］.雲南植物研究，1998，20(4)：434438.

　　［3］ 李鈞敏，金則新，楊蓓芬.雲錦杜鵑總黃酮含量及成分分析［J］.西北林學院學報，2004，19(1)：110112.

　　［4］ 邢俊波，李萍，溫德良.不同物候期金銀花中總綠原酸的積累動態研究［J］.中國中藥雜誌，2001，26(7)：456459.

　　［5］ 王衝之，孫健，李萍.貝母類藥材生物堿及生物堿苷含量測定方法學研究［J］.中國藥學雜誌，2003，38(6)：417418.

　　［6］ 宋永良.複方乳鴿膠囊中絞股藍總皂甙含量測定［J］.浙江中醫學院學報，2002，26(3)：77.

　　［7］ 陳紅紅，黃麗玫.德慶等地巴戟天中蒽醌及多糖的含量測定［J］.廣東藥學院學報，2002，18(2)：103105.

　　［8］ 王莘，蘇玉春，董浩，楊會敏，王建華，李金風.9種中藥提取物對乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用比較［J］.中草藥，2004，35(3)：309310.

［9］ 杜近義，胡國賦，秦際威.植物次生代謝產物的生態學意義［J］.生物學雜誌，1999，16(5)：910.

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