摘 要
全球性的細菌抗生素耐藥是近年來感染性疾病治療所麵臨的一大難題[1][2]，細菌可對某類抗菌藥物產生耐藥性，也可同時對多種化學結構各異的抗菌藥物耐藥。隨著各種新型抗生素在臨床的應用，細菌的耐藥也越來越廣。本文對細菌耐藥機製及自動化儀器檢測耐藥機理等方麵的新進展作簡要綜述。
一、耐藥性的分類：
細菌耐藥性可分為：（1）天然或突變產生的耐藥，即染色體遺傳基因介導的耐藥。屬於此種耐藥性者如肺炎克雷伯菌和催產克雷伯菌可產生由染色體介導的青黴素酶，因而對氨苄西林和羧苄西林耐藥等。（2）質粒介導的耐藥性，即細菌因獲得了由質粒、噬菌體或其他外來DNA片段，所致的細菌耐藥，其所帶的耐藥基因易於傳播，在臨床上占有重要地位。
二、細菌的耐藥機製：
（一）β內酰胺類藥物耐藥
針對β內酰胺類抗生素的耐藥機製主要有：產生β內酰胺酶；青黴素結合蛋白（PBP）的作用位點改變或產生新的對β內酰胺類抗生素不敏感的PBP；革蘭陰性細菌外膜通透性降低和主動外排係統將抗生素泵出胞外。PBPs改變是革蘭氏陽性菌耐β－內酰胺類抗生素的最主要機製，β－內酰胺酶是革蘭氏陰性杆菌耐β－內酰胺類抗生素的最普遍的機製。
（二）β內酰胺酶介導的細菌耐藥
β內酰胺酶早在β內酰胺類抗生素應用於臨床前便已發現，它並不是細菌生長所必需的，因為它的唯一功能是水解β內酰胺。革蘭陽性菌的β內酰胺酶分泌到細胞外，而革蘭陰性菌的β內酰胺分泌到胞周間隙[3]。最近Bush更新的版本，結合酶的分子結構、抑製特性及水解底物特征來進行分類。見下表
（1）β內酰胺的作用機製：
β內酰胺是結構類似於細胞壁前體肽聚糖肽酰－D丙氨酰基－D－丙氨酸未端的類似體，能與PBPs和β內酰胺酶互相反應，β內酰胺結合物，PBPs和β內酰胺酶經過連續的酰化作用和脫酰基作用反應，β內酰胺環發生親核攻擊使環打開，並形成通過脂鍵相連的乙酰酶中間體；通常PBP和β內酰胺酶的主要區別在於酰基化的速率不同，這主要是因為它們對水分子的依賴性不同。對β內酰胺酶來說，水分子是有效的親核攻擊分子，它能迅速水解乙酰酶中間體的脂鍵使酶再生，並釋放β內酰胺部分，細菌產生耐藥性。而對PBP來說，乙酰酶中間體對水分子的親和攻擊不敏感，因而乙酰酶中間體不能被水解或水解的速率很慢，從而使PBP失活。
（2）革蘭陽性菌β內酰胺酶介導的細菌耐藥：
在青黴素G應用於臨床不久，β內酰胺酶便在葡萄球菌中廣泛分布。目前90％以上的金黃色葡萄球菌中的β內酰胺酶屬於Bush分類的2a組。與革蘭陰性菌β內酰胺酶不同，盡管麵臨著對β內酰胺酶穩定的抗生素的選擇性壓力，幾十年來金黃色葡萄球菌中的產β內酰胺酶、對青黴素耐藥的金黃色葡萄球菌仍然對半合成青黴素（如苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林等）、頭孢菌素及碳青酶烯類抗生素敏感。金黃色葡萄球菌β內酰胺酶的產生通常是可誘導的，共涉及至三個基因：blaⅠ、blaR1和blaR2。blaⅠ編碼一種抑製因子，對β內酰胺酶結構基因blaZ的轉錄進行負調節；blaR1編碼的蛋白BlaR1包括一個細胞外的區域用來感受β內酰胺類藥物，一個細胞內區域負責產生一種信號導致blaZ的去抑製；blaR2基因下調β內酰胺酶的表達，其機製不明。
（3）革蘭陰性菌β內酰胺酶介導的細菌耐藥：
盡管革蘭陰性菌種發現了多種酶，TEM－1和SHV－1分別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中最主要和最多見的酶。這些分布廣泛的酶屬於Bush分類2b組，由質粒介導，通過接合、轉化和轉導等形式使耐藥基因在細菌中擴散，可有效地水解青黴素和窄譜頭孢菌素酶，但不能水解廣譜的氧亞胺頭孢菌素、頭黴素和碳青酶烯類抗生素，即使這些酶過度表達也不能介導細菌對上述抗生素的耐藥，但可導致細菌對酶抑製劑的耐藥。
20世紀80年代初，隨著三代頭孢菌素的臨床應用，多年來一直穩定的TEM－1和SHV－1酶突然加快了突變的步伐，短短幾年由於這兩種酶的某些位點的突變而形成的各種超廣譜β內酰胺酶在世界各地不斷被發現；這些酶介導的細菌對青黴素和一、二、三代頭孢菌素以及單環菌素耐藥，但對頭黴素、碳青酶烯及酶抑製劑敏感，屬於Bush分類2b組。從ESBL的分子結構看，其活性作用位點絲氨酸－70位於由四段氨基酸保守序列圍成的催化腔底部，β內酰胺類抗生素隻有進入催化腔的底部才能被酶水解。ESBL的突變位點一般位於上述保守序列的周圍，目前已發現的幾十種ESBL其突變位點主要集中在TEM－104、－164、238、－240位點和SHV－179、－238、－240位點，其中164、179、238位點中任一點的突變都將導致催化腔體積的增大，使分子結構較大的三代頭孢菌素能夠進入；在此基礎上104、240等位點的突變將酶對三代頭孢菌素的親和力增強，從而進一步提高其水解效率。另外突變的位點不同其水解效率也不同，如238位點的突變主要促進酶對頭孢噻肟的水解，而240、104等位點的突變主要促進酶對頭孢他啶的水解，所以抗生素的使用情況不同，ESBL的類型在不同國家和地區是不同的。
XTX－M係列ESBL是近年來在世界各地被發現的非TEM和非SHV起源的ESBL，包括CTX－M1－10、Toho－1和Toho－2，它們的主要特征是對頭孢噻肟水解力強，而對頭孢他啶水解力弱，因此體外藥敏試驗中產生此酶的菌株常對頭孢噻肟耐藥而對頭孢他啶較敏感。三代頭孢菌素的廣泛使用引起細菌產生多種新的β內酰胺酶，其中以超廣譜β內酰胺酶最具重要意義，主要由腸杆菌科細菌，尤其大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產生；大多由編碼TEM－1基因和SHV－1基因突變而形成；多數可為β內酰胺酶抑製劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑製。它可以水解青黴素類、一代、二代、三代頭孢菌素和氨曲南，導致細菌對第一代、第三代頭孢菌素、替卡西林、呱拉西林和氨曲南耐藥，有趣的是，這些酶大多數可被棒酸及舒巴坦抑製，克雷伯菌例外，頭黴菌素和碳青黴烯不受影響[3][13][14]。由於其可傳播性和對三代頭孢菌素表現敏感而引起誤導治療問題，被認為是革蘭氏陰性杆菌中最危險的耐藥形式[15]，且它的產生使治療更加困難，抗菌藥物的選擇範圍更窄，目前多選用亞胺培南治療，ESBL陽性的革蘭陰性杆菌應在報告注明，提示醫生勿用β－內酰胺類藥物。ESBL主要在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中出現，然後又在假單胞菌、不動杆菌、流感嗜血杆菌和奈瑟菌中發現[13][16][17]。當懷疑產ESBL或經驗用藥治療失敗時，應考慮ESBL產生，避免使用除頭黴菌素、卡巴培能以外的其它頭孢菌素[18]。
AmpC酶的耐藥機製：
AmpC酶是由染色體介導的β內酰胺酶，屬於Bush分類1組（C類），在自然狀態下細菌產生此種酶的量很少，但某些細菌如陰溝腸杆菌、弗氏枸櫞酸杆菌等在β內酰胺類抗生素（尤其是頭孢西叮、亞胺配能和克拉維酸）的作用下可大量誘導AmpC酶的產生，而且其調控基因的突變率很高，突變後將使酶持續大量產生，導致細菌對除碳青酶烯類之外的所有β內酰胺類抗生素耐藥。AmpC酶的誘導機製很複雜，共涉及四個連續基因，即ampC、ampR、ampD和ampG，並與細菌細胞壁肽聚糖的循環合成有關。近年來此耐藥基因已開始向質粒擴散，給臨床帶來更嚴峻的挑戰。近年也有少數質粒介導的AmpC酶在不同國家被發現。AmpC酶屬於Class C類酶[3]又稱頭孢菌素酶，它是Bush1類β內酰胺酶的典型代表，能水解青黴素類，一代、二代和三代頭孢菌素類和單環類，不被克拉維酸抑製，體外試驗尚能誘導細菌產AmpC酶[19]，舒巴坦和他唑巴坦的抑製效果非常有限[20]，但硼酸類化合物和氯唑西林體外有較好的抑製作用。AmpC酶可分為誘導型，去阻遏持續高產型和質粒型。絕大多數革蘭陰性杆菌都具有產生AmpC酶的能力，通常情況產酶量很少，在臨床上並不形成耐藥，但一旦細菌阻遏AmpC酶產生的基因發生突變，細菌就可持續高產AmpC酶，出現對絕大多數β內酰胺抗生素的耐藥。此外還應注意到在傳統認為隻產AmpC酶的腸杆菌屬細菌中，ESBL可能並不少見，細菌一旦同時具有高產AmpC酶及產ESBL的能力，其耐藥性將極其嚴重。
誘導型AmpC酶：當細菌未接觸有誘導力的β內酰胺類抗生素時，染色體的ampC基因被基因阻遏子抑製，產酶處於基線水平。當使用有誘導力的抗生素治療時，產生了暫時的去阻遏現象。AmpC基因自由表達，使得細菌暫時產生過量的β內酰胺酶。一旦去除抗生素，大多數情況下產酶水平水逐漸恢複到基線水平。臨床應用β內酰胺類抗生素阻斷了細菌細胞壁五肽交朕橋連接，引起肽聚糖合成紊亂，產生大量肽聚糖片斷，當革蘭陰性菌周質間隙或胞漿中肽聚糖片段的量超過AmpD蛋白循環利用能力時，感受器或跨膜轉運係統AmpG蛋白可傳遞或攝取肽聚肽聚糖片段的刺激信號，使AmpR蛋白形成激活子，激活ampC基因轉錄及ampR基因自我轉錄，誘導細菌產生AmpC酶。大腸埃希菌的AmpC酶低水平表達，它缺少ampR基因而不能誘導產酶[21]。
去阻遏持續高產AmpC酶：在產誘導型AmpC酶的革蘭陰性菌中，可發生較高頻率的調節基因自發突變，調節基因的作用受到抑製[22]，AmpD調節基因突變產生有缺陷的AmpD蛋白，使菌株去阻遏持續高產AmpC酶，亦可產生高誘導型或溫度敏感型AmpC酶[23]。
質粒型AmpC酶：20世紀80年代以前，AmpC酶多數報道為染色體型，20世紀80年代後有許多文獻證實大量使用三代頭孢菌素與AmpC酶的產生有密切關係。質粒型AmpC酶的出現與頭黴菌素（如頭孢西丁和頭孢替坦），加β內酰胺酶抑製劑複合抗生素使用量增多產生的選擇壓力有一定的關係，從分子大小、結構、等電點、生化特性等非常類似於染色體酶，這種酶較超廣譜β內酰胺酶有更廣泛的耐藥譜，又不能酶抑製劑類破壞[24、25]。
1988年，Papanicolaou等首次在肺炎克雷伯菌的質粒上捕獲到頭孢菌素酶，這種耐藥性可以轉移，並與陰溝腸杆菌ampC基因同源。1994年，在弗勞地枸櫞酸杆菌中發現攜帶頭孢菌素酶的耐藥質粒，可以轉移至大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，並編碼產生AmpC酶，形成質粒型AmpC酶，增加了傳播力。目前質粒介導的AmpC酶種類也在不斷地增加，現已發現了26種質粒AmpC酶[25]。
隨著20世紀80年代早期以來新的β內酰胺酶類抗生素的廣泛使用，產AmpC酶的革蘭陰性杆菌已逐漸成為醫院感染的流行菌[4]。1978年首次報道了應用新的β內酰胺類抗生素過程中篩選出產生高水平染色體酶的變異株[26]，它幾乎對當前所有的β內酰胺類抗生素（除亞胺培南外）耐藥。這種耐藥性已在腸杆菌屬、弗勞地枸櫞酸杆菌、摩根菌屬、粘質沙雷菌、銅綠假單胞菌等臨床分離株中報道，並涉及每一種新的頭孢菌素類、部分青黴素類和氨曲南[27]。這類報道大多數是腸杆菌屬細菌引起的感染。在美國，腸杆菌屬造成的醫院感染菌血症占5％至7％；在ICU，分別占常見呼吸道感染的第三位，尿路感染第五位，手術傷口感染第四位[28]。其中最常見是陰溝腸杆菌和產所腸杆菌感染，特別當存在以下危險因素時，如長期住院（尤其ICU），嚴重的基礎疾病，各種原因的免疫抑製、高齡、導管裝置、抗生素使用等。腸杆菌屬感染的爆發流行主要發生在大量使用頭孢菌素和其他廣譜β內酰胺類抗生素的腫瘤病房或新生兒、心髒外科的ICU。造成感染爆發流行的多種細菌來源於病人自身的腸道菌群。正是由於使用原有的或新的頭孢菌素而形成的選擇性壓力，腸杆菌屬細菌逐漸成為腸道菌中的優勢菌，最終造成許多病人感染。不僅產AmpC酶的腸杆菌科細菌在醫院的流行呈上升趨勢，而且這些細菌形成多重耐藥的趨勢也不斷上升。1991年，Chow等[27]對129例成年人研究發現，在腸杆菌屬細菌所致的菌血症中，使用第三代頭孢菌素治療比使用氨基糖苷類或其他β內酰胺類治療更容易導致多重耐藥性的產生。這主要與新的頭孢菌素的使用增加，以及醫院的規模和病人數密切相關。但這種趨勢是可以改變的，當減少或終止頭孢菌素類的使用時，可減少產誘導酶的腸杆菌科細菌的流行和耐藥菌株的出現[27]。
2、PBP改變介導的細菌耐藥：
青黴素結合蛋白（PBP）位於細菌細胞質膜外壁，是在細菌細胞壁肽聚糖合成後期起轉肽酶、轉糖苷酶、肽鏈內切酶及羧基肽酶等的作用的一係列酶，它們也是β內酰胺類抗生素的作用靶位。幾乎所有細菌都具有3－8種PBP，其命名以數字表示（如PBP1、2、3等）：分子量越大數字越小。需注意的是，在不同屬或種的細菌中，盡管命名的數字相同，但它們並不一定相關。β內酰胺類抗生素一般具有多個潛在的作用靶位，因為2－4個PBP是細菌生存所必需的[3]。
（1）革蘭陽性菌PBP改變介導的細菌耐藥：
PSP改變包括獲得新的對抗生素低親和力的PBP和本身發生修飾導致對抗生素的親和力下降的PBP，前者主要發生在葡萄球菌中，後者主要發生在肺炎鏈球菌中。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）對所有β內酰胺類抗生素均耐藥，其原因是由於獲得了未知起源的DNA編碼的新的耐β內酰胺PBP，它由染色體mecA基因編碼，被命名為PBP2a。
MecA基因的表型表達受多種因素的影響，包括PH、溫度、滲透性、上遊調節序列和其他不相關染色體基因。有些MRSA的mecA基因上遊存在著調控基因mecR1和mecI，其序列和功能分別與β內酰胺酶的調控基因blaR1和blaI 相似，對mecA的表達進行負調控。MecA基因的轉錄，即PBP2a的表達有三種形式：（1）非誘導持續表達型，此型MRSA缺少mecR1－mecI基因和β內酰胺酶質粒；（2）即誘導型，此型MRSA缺少mecR1－mecI基因而具有β內酰胺酶質粒，通過β內酰胺酶的調控基因blaR1和blaI調控mecA的表達；（3）延遲表達型，此型MRSA具有mecR1－mecI基因，其耐藥性在甲氧西林誘導後48小時才能充分表達，臨床常規藥敏試驗常誤將此型菌株判斷為敏感，因此具有重要的臨床意義，另外，除mecA基因外甲氧西林的耐藥還與fem基因（包括femA、B、C、D、E、F等）的表達有關。Fem的功能是直接或間接參與細菌細胞壁的生物合成，不影響PBP2a的生成，但其缺失將導致細菌對甲氧西林的耐藥性降低。
肺炎鏈球菌不產生β內酰胺酶，其對β內酰胺類抗生素的耐藥是由於PBP（主要是PBP2）發生改變而導致對β內酰胺的親和力降低。肺炎鏈球菌包括6種PBP（1a、1b、2a、2x、2b和3），其青黴素敏感株的染色體pbq基因則變異較大，稱為嵌合體基因，因為它包括敏感株相應部分基因和可能有相近菌種轉化而來的基因。肺炎鏈球菌的耐藥是一個連續突變的過程，單個突變會導致低水平耐藥，而高水平耐藥則是多個pbq基因連續突變的結果，如對廣譜頭孢菌素的耐藥涉及到PBP1a、2x的改變。另外在不同抗生素的選擇下其突變位點也不同，因此對廣譜抗生素耐藥並不一定對青黴素耐藥。
糞腸球菌和屎腸球菌對低水平青黴素的固有耐藥是由於具有青黴素低親和力的PBP5，糞腸球菌中常見的高水平的耐藥與PBP5過量產生和氨基酸突變有關。
（2）革蘭陰性菌PBP改變介導的細菌耐藥：
PBP改變介導的細菌耐藥在革蘭陰性菌中較少見，主要在銅綠假單胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、醋酸鈣不動杆菌和脆弱類杆菌中。在淋病奈瑟菌（非TEM－產生株）中染色體倡導介導的高水平青黴素耐藥與低親和力PBP1、2的產生有關。
3、外膜滲透性降低和主動外排導致的β內酰胺耐藥：
這種耐藥主要見於革蘭陰性菌。革蘭陰性菌的外膜對β內酰胺類抗生素是一種屏障，抗生素的內流和清除（水解或捕獲）之間平衡決定了細菌的敏感和耐藥。在大腸埃希菌和其他陰性菌中β內酰胺類抗生素主要由親水的膜蛋白孔道通過外膜，前者至少產生兩種膜蛋白孔道，OmpF和OmpC。由於突變導致OmpF和/或OmpC改變或表達減少將使細菌對多種β內酰胺類抗生素敏感性下降。銅綠假單胞菌對多種β內酰胺類抗生素呈現固有的耐藥性，長期以來將這種耐藥性歸結為該菌具有低通透性外膜。現在已認識到這種耐藥性是由於能量依賴的主動外排係統[9－10]（MexAB－OprM）和低通透性外膜協同作用的結果，最近有資料顯示MexAB－OprM係統通過外排可直接介導對β內酰胺類抗生素的耐藥。
對於介導細菌多重耐藥性的主動外排泵的研究則起於10年前對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌多重抗生素的研究[9]。近年的研究還發現許多革蘭陽性球菌和革蘭陰性杆菌的細胞膜存在能量依賴性外排係統，使菌體內的藥物量減少。盡管細菌耐藥主動外排轉運體種類眾多，但是目前研究顯示“耐受－－生節－－分裂家族”（RND類）的主動外排泵係統與細菌多重耐藥性形成密切相關。RND藥物外排係統普遍存在於革蘭陰性杆菌中，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、分枝杆菌等，同時多種革蘭陽性菌中都已發現與細菌耐藥性形成有關的由細菌染色體編碼的藥物外排係統，如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌及枯草杆菌等。此外當細菌同時存在多種耐藥機製時，不同的耐藥機製彼此產生協同或相加作用共同提高細菌耐藥水平。藥物主動外排泵係統與其他細菌耐藥機製具有協同作用提高細菌耐藥水平，例如銅綠假單胞菌MexAB－OprM與其外膜屏障發揮明顯的協同作用[11]。當有多種主動外排泵係統同時發表達時，外排作用可獲加強[12]。
（三）氨基糖苷類耐藥：
氨基糖苷類主要作用於需氧革蘭陰性菌和革蘭陽性球菌，對鏈球菌和腸球菌往往無效。天然氨基糖苷類耐藥主要是藥物的攝入減少，而獲得性耐藥主要產生質粒編碼的修飾酶。此外獲得性耐藥也可通過染色體變異引起的核蛋白體靶位改變或抗生素攝入減少等產生。
1、攝入藥物減少：抗生素攝入減少會引起細菌對所有氨基糖苷類天然或獲得性低水平的交叉耐藥。氨基糖苷類是一類分子量較大的複合物，它主要作用於細菌質核糖體，在作用靶位前要經過細菌外膜（革蘭陰性菌）和胞質膜（革蘭陰性菌和陽性菌）。在革蘭陰性菌中，首先須通過離子結合，破壞外膜上陰離子物質，包括脂多糖、外膜蛋白和兩端的磷脂。二價陽離子Mg離子和Ca離子是脂多糖和磷脂結合所必需，氨基糖苷類中的陽離子可取代二價Ca離子，使抗生素穿透胞膜進入胞漿。某些菌株對氨基糖苷類敏感性降低，就是因為一些離子轉移係統缺陷，造成藥物攝入減少，如腸球菌、鏈球菌和某些腸杆菌科細菌。
2、氨基糖苷的修飾酶：此酶是通過質粒介導由革蘭陰性菌或部分陽性菌產生的鈍化酶，能使氨基糖苷類抗生素失活，已知的鈍化酶有三類：（1）乙酰轉移酶（AAC），使遊離羥基乙酰化；（2）核苷轉移酶（ANT），使遊離羥基核苷化；（3）磷酸轉移酶（APH），使氨基糖苷類遊離羥基磷酸化。其中，磷酸轉移酶對抗生素的耐藥性最高。一種鈍化酶可產生不同的耐藥表型。一種氨基糖苷類藥物能被一種或多種酶所鈍化，而幾種氨基糖苷類藥物也能被同一種酶所鈍化。因此在不同的氨基糖苷藥物間存在著不完全的交叉耐藥性。產生鈍化酶的質粒（或DNA片段），可通過接合方式在細菌細胞間轉移，使原來不耐藥的菌細胞產生耐藥性。
3、核蛋白體靶位修飾：在大腸杆菌K－12菌株中，由於rpsl基因發生改變，使核蛋白體S12蛋白發生改變，而對鏈黴素產生很高的耐藥性。因核蛋白體靶粒修飾改變產生對鏈黴素耐藥的菌株還有淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌。耐鏈黴素的結核分枝杆菌也是由於16SrRNA和核蛋白體S12基因發生突變引起。
（四）大環內酯、林可黴素耐藥：
在革蘭陰性杆菌中，細胞壁外膜對疏水性藥物的滲透性低是導致細菌對大環內酯類和林可黴素等抗生素固有耐藥的原因，而獲得性耐藥多見於核糖體靶粒的改變及抗生素的滅活。
靶粒修飾：
大環內酯類抗生素與林可黴素的化學結構不同，但作用機製相似，它們能結合到50S核蛋白體亞基上，抑製肽鏈延長。對這些抗生素耐藥常常因為獲得erm基因（紅黴素耐藥的甲基化酶），erm基因編碼產生的酶能將23SrRNA上一個特異性腺嘌呤殘基6位雙甲基化。對從實驗室分離出的大量甲基化酶的分析中可以看出，這些酶修飾位於rRNA保留區中類類似的腺嘌呤殘基，而核蛋白體的甲基化導致對大環內酯類和林可黴素交叉耐藥。也可能是甲基化改變了核糖體的構象，通過使抗生素結合位點發生重疊而降低對抗生素的親和力。
對大環內酯類抗生素和林可黴素耐經的表達可經誘導和構建得到。其表達類型和erm基因種類無關，而取決於甲基化酶結構基因中上遊調節區，調節區域中單個核苷酸的置換、刪除、複製可誘導出對大環內酯類和林可黴素交叉耐藥的重組耐藥株。
金黃色葡萄球菌的誘導性僅對大環內酯類中紅黴素、鹽酸紅黴素、疊氮紅黴素耐藥、對螺旋黴素、交沙黴素等和林可黴素類依然敏感，產生對這類抗生素間不同的耐藥性是由於紅黴素、鹽酸紅黴素和疊氮紅黴素能有效誘導甲基化酶的合成。鏈球菌的耐藥同樣也可通過誘導和重組獲得。
在某些葡萄球菌中，對大環內酯類和林可黴素類抗生素的耐藥株常由攜帶ermC決定因子的非結合型小質粒介導。除肺炎鏈球菌外，幾乎在所有的鏈球菌都發現了耐藥性質粒，在肺炎鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌中證實質粒DNA缺失引起耐藥性的轉移。
抗生素滅活：靶粒修飾是對結構不同的抗生素的耐藥，抗生素的酶滅活僅導致對結構相同藥物的耐藥。從口服紅黴素的胃腸炎患者身上可分離到對紅黴素高度耐藥的腸杆菌，這些耐藥株通過產生紅黴素酯酶或通過2－磷酸轉移酶催化的磷酸化反應破壞大環內酯類藥物的酯環。現已發現由ereA和ereB基因編碼的酯酶I和II，在對紅黴素高度耐藥的腸杆菌中經常發現ereA和ereB的複合物（編碼rRNA甲基化酶），這也證實了兩種基因產物之間的協同作用。臨床上對林可黴素高度耐藥多由產生核苷酸轉移酶引起。
抗生素的活性泵出：當前約有15％－20％的肺炎鏈球菌和相當數量的化膿性鏈球菌對大環內酶類藥物耐藥，其耐藥機製不是酶滅活作用，而是存在編碼產生抗生素泵出係統的mefE和mefA決定因子。凝固酶陰性葡萄球菌對大環內酯類抗生素的耐藥多由於產生ermC甲基化酶，但也有相當數量因為藥物的活性泵出而導致耐藥。金黃色葡萄球菌和部分凝固酶陰性葡萄球菌中msrA基因編碼產生一種具有轉運功能的蛋白，導致對大環內酯類抗生素耐藥。
（五）四環素耐藥：
自然界細菌對四環素耐藥最為多見，其發生機製主要為獲得外源性DNA編碼產生四環素泵出係統，或具有核蛋白體保護作用的蛋白質，也可以因為染色體突變導致外膜滲透性降低。
1、滲透性改變：大腸埃希菌中染色體突變引起外膜蛋白OmpF減少，阻礙四環素進入菌體，導致對四環素耐藥，在四環素存在下可以選擇出對四環素及其他多種抗生素高度耐藥的菌株。其耐藥是因存在著多重耐藥係統（MAR），包含marRAB操縱子，可減少OmpF外膜蛋白數量，這一操縱子也可被四環素抑製，同時mar操縱子的激活也可導致四環素的活性泵出，使耐藥性增加，在腸杆菌科多種菌屬如沙門菌屬、誌賀菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸菌屬、腸杆菌屬中都已檢出mar係統。
2、藥物泵出：菌體編碼產生藥物泵出係統是導致對四環素耐藥的重要機製，這一過程由膜蛋白Tet通過攝入質子、排出四環素－陽離子複合物完成。通過DNA－DNA雜交，從臨床菌株中可分離出8種編碼泵出係統的基因：tet（A）—（E）基因在革蘭陰性菌中廣泛檢測出；ter（P）基因存在於梭菌屬細菌中，由編碼功能基因tetA（P）和tetB （P）的複合基因組成，tetA（P）編碼與泵出有關的膜轉運蛋白，tetB（P）編碼類似tetM的核蛋白體保護蛋白；tet（K）和tet（L）基因僅發現於革蘭陽性菌。銅綠假單胞菌對包括四環素在內的許多抗生素固有耐藥，其機製極可能是存在藥物泵出係統。
3、核蛋白體保護作用：通過降低30S核蛋白體亞基A位點和P位點對氨基酰tRNA的親和力，四環素發揮其抗菌作用。對四環素耐藥通常可因產生一種蛋白質，這種蛋白質和核蛋白體相互作用，使蛋白質合成不受抗生素影響，稱核蛋白體保護作用。核蛋白體保護作用可受到tRNA修飾的阻礙，具體機製尚未闡明。現已分離出5種核蛋白體保護作用基因：tetM、tetO、tetP、tetQ、tetS。TetM分布極為廣泛，可在奈瑟菌屬、金氏菌屬、埃肯菌屬和杜克嗜血杆菌中檢出，在支原體及脲原體中也有發現，它更多作為Tn916相關的結合性轉座子的一部份見於染色體上，這些轉座子有自我轉移性，宿主範圍廣，在四環素存在時轉移頻率增加，四環素可以調節增強其表達；tetO可在彎曲菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬中檢出；tetP在產氣莢膜梭菌中檢出；tetQ在類杆菌中檢出；tetS在產單核細胞李斯物菌和糞腸球菌中發現。
（六）磺胺和甲氧嘧啶耐藥：
1、固有耐藥：外膜滲透性降低使銅綠假單胞菌對甲氧嘧啶和磺胺耐藥；奈瑟菌屬、梭菌屬、布魯菌屬、類杆菌屬、莫拉菌屬、諾卡菌屬以甲氧嘧啶固有耐藥，是由於抗生素和細菌DHFR親合力低；腸球菌屬、乳杆菌屬某些細菌屬營養缺陷型細菌能利用外源性葉酸，表現出對磺胺和甲氧嘧啶低度敏感，腸球菌也可利用外源性胸腺嘧啶，不受葉酸合成途徑拮抗劑的抑製。
2、對甲氧嘧啶獲得性耐藥：（1）染色體突變：在臨床上常可見到DHFR結構基因突變引起對甲氧嘧啶耐藥的菌株，如大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血杆菌等，在肺炎克雷伯菌、產氣腸杆菌、陰溝腸杆菌中發現染色體突變導致的外膜滲透性下降，及對萘啶酸、甲氧嘧啶、氯黴素交叉耐藥。這些菌株多重耐藥與外膜蛋白數量減少有關。染色體突變滅活胸苷酸合成酶，導致對磺胺甲氧嘧啶合成並高度耐藥，這些突變株需要外源性胸苷或胸腺嘧啶合成DNA，對葉酸合成途徑拮抗劑不敏感。（2）質粒介導耐藥：導致腸杆菌科一些細菌對甲氧嘧啶高度耐藥最常見原因是獲得外源性DNA產生過量DHFR；產生的DHFR被甲氧嘧啶抑製的敏感性低於染色體介導的酶。在革蘭陰性菌，尤其是大腸埃希菌中，通過動力學、一級結構分析、DNA－DNA雜交可至少分出6種不同的DHFR；相比之下，革蘭陽性菌兩型（S1和S2型）。
DHFR中分布最廣泛的是DHFR I型，導致對甲氧嘧啶高度耐藥，其相應基因dhfr I位於轉座子Tn7，而且dhfr I基因是轉動基因，能在Tn7轉座子外檢出，dhfr II 型對甲氧嘧啶敏感性最低；dhfrⅢ型在傷寒沙門菌和誌賀菌屬某些種檢出，引起對甲氧嘧啶耐藥；dhfr Ⅳ型能被甲氧嘧啶誘導。
在革蘭陽性菌中，DHFR S1型普遍存在，在金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人型葡萄球菌中都已檢出由dhfr A基因編碼的DHFR S1型酶。近年在產單核細胞李斯特菌、溶血葡萄球菌中還發現了DHFR S2型酶，存在於葡萄球菌和李斯特菌中的S1型酶可能會表現出可移動性和突變性的特征，和染色體介導的表皮葡萄球菌的酶一樣，因為二者氨基酸序列極為相似。
3、對磺胺獲得性耐藥：（1）染色體突變：在奈瑟菌屬細菌和金黃色葡萄球菌中，染色體突變可導致PABA增多，產生對磺胺耐藥。大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌的耐藥與dhps基因突變有關，突變的dhps基因編碼產生對磺胺低親合力的DHPS。（2）質粒介導：獲昨了編碼產生耐藥性DHPS的質粒可導致對磺胺獲得性耐藥。在革蘭陰性菌中已分離出分別由sul I 和sul II基因編碼的耐藥性DHPS I型和II型。幾乎所有的sul I基因和其他耐藥基因相聯，位於由大結合質粒攜帶的整合子保留片段上；sul II基因常和鏈黴素耐藥基因相聯，存在於宿主範圍廣的質粒和小的非結合性質粒上，在臨床分離的耐藥株中，sul I 和sul II基因檢出率大致相同。
（七）喹諾酮類耐藥：
1、DNA螺旋酶和拓樸異構酶Ⅳ的改變：在細菌生長和分裂中，DNA螺旋和拓樸異構酶Ⅳ有著非常重要的作用，喹諾酮作用於其上則起到抗菌作用。然而編碼螺旋酶和拓樸異構酶亞基的基因發生突變可導致對喹諾酮耐藥。
臨床試驗也已證明gyrA基因的突變引起對喹諾酮高度耐藥，幾乎所有gyrA耐藥突變都位於喹諾酮耐藥決定區的130bp序列中，在革蘭陰性和陽性菌中都有發生；gyrB基因的突變也引起對喹諾酮的耐藥，但程度不高。臨床耐藥株大多數由gyrA突變引起，另一因子parC的突變也會使耐藥水平增強，但其突變發生於gyrA之後。
在革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌中，對氟喹諾酮的耐藥也由gyrA和parC基因突變引起。相比革蘭陰性菌而言，氟喹諾酮首先作用於革蘭陽性菌拓樸異構酶Ⅳ，因而在對環丙沙星耐藥的金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌中，parC的突變先於gyrA。這也提示革蘭陰、陽性細菌parC突變有根本不同。
2、外膜滲透性降低及藥物泵出：由外膜變化引起抗生素進入菌體中減少可導致對喹諾酮耐藥，對喹諾酮耐藥是多重耐藥表型的一個特征，這一多重耐藥和mar位點突變有關。在對銅綠假單胞菌的研究中已鑒定出多種位點，這些位點突變要改變外膜蛋白，從而降低滲透性導致耐藥。在銅綠假單胞菌中還分離出因藥物泵出表達耐藥的菌株，對多種抗生素耐藥。在金黃色葡萄球菌中也發現了活性泵出係統，由norA基因編碼產生，該基因過量表達導致耐藥。
（八）氯黴素耐藥：
1、酶滅活作用：氯黴素有2個羥基，可被氯黴素轉乙酰基酶乙酰化，在這反應中乙酰輔酶A為乙酰基供體。乙酰化作用先發生在C3羥基，形成3－乙酰氯黴素，在不需酶催化下3－乙酰氯黴素轉位形成1－乙酰氯黴素，再乙酰化為1，3二乙酰氯黴素，一乙酰氯黴素和二乙酰氯黴素都不能結合到50S核蛋白體亞基上。通過對腸道細菌突變株的研究，發現不同突變株其氯黴素轉乙酰基酶組成都是由相同亞基組成的三級結構。（1）革蘭陽性菌中的氯黴素轉乙酰基酶：在金黃色葡萄球菌中通過電泳技術現已分離出5種不同的氯黴素轉乙酰基酶：A、B、C、D及由質粒PC194編碼的氯黴素轉乙酰基酶。編碼酶的結構基因常位於小多拷貝質粒上，基表達可由氯黴素誘導；對氯黴素耐藥的糞腸球菌和肺炎鏈球菌產生一種可誘導的氯黴素轉乙酰基酶，產氣莢膜梭菌有2個基本表達決定因子：catP和catQ。（2）：革蘭陰性菌中氯黴素轉乙酰基酶：在革蘭陰性菌中，對氯黴素耐藥的菌株常由質粒或轉座子的基因誘導，這些基因常被完整表達，在腸道細菌中現已鑒定出了3個型別的酶（I、Ⅱ、Ⅲ型），I型酶普遍存在，能特異性緊密結合類固醇類抗生素，編碼氯黴素轉乙酰基酶1型的基因常位於Tn9轉座子上。近來檢出一群基因，能編碼催化乙酰輔酶A到氯黴素，但其結構和典型的氯黴素轉乙酰基酶不同，稱為外來乙酰基轉移酶，包括銅綠假單胞菌和腫脹土壤杆菌中染色體編碼的酶。在大腸埃希菌多重耐藥轉座子Tn2424上發現一氯黴素耐藥決定因子，編碼產生XAT1、Tn2424和Tn21接近，其核苷酸序列區位於xat基因一側，提示此耐藥基因是整合子的一部分，與耐藥基因的表達和播散有關。
2、滲透性降低：染色體突變導致外膜滲透性降低也會引起某些革蘭陰性菌對氯黴素耐藥，如在流感嗜血杆菌和傷寒沙門菌中，對氯黴素的高度耐藥株主要與外膜蛋白數量下降及特異性外膜蛋白缺失有關；銅綠假單胞菌中cmlA基因可使外膜蛋白ompA和ompC表達減少，使進行菌體的氯黴素減少。
（九）糖肽類耐藥：以下主要介紹腸球菌耐糖肽類抗生素的耐藥機製，其中又以獲得性耐藥為主，獲得性耐藥的主要表型是VanA和VanB。
VanA型菌株主要由屎腸球菌和糞腸球菌分離得到，對萬古黴素和肽可黴素高水平耐藥，耐藥性可通過接合轉移給敏感菌株。VanA型耐藥基因由11kb轉座子Tn1546攜帶，Tn1546編碼9個多肽，這9個多肽同作用賦予細菌對萬古黴素的高水平耐藥，UDP－胞壁酸五肽的D－丙氨酸－D－丙氨酸上的NH基被D－丙氨酸－D－乳酸的氧所取代，從而取消了肽聚糖前體與抗生素之間原有的一個氫鍵並使得原來的空間構象發生改變，結果是D－丙氨酸－D－乳酸取代了D－丙氨酸－D－丙氨酸。D－丙氨酸－D－乳酸的產生主要依靠三種酶的作用，VanA連接酶、VanH脫氫酶和VanX二肽酶。VanH脫氫酶催化丙酮酸水解成乳酸，VanX二肽酶破壞D－丙氨酸－D－丙氨酸的連接鍵，VanA連接酶催化D－丙氨酸－D－乳酸形成。另外VanR基因和VanS基因的產物VanR基因和VanS基因的產物VanR、VanS蛋白與VanA耐藥調控有關，在萬古黴素的誘導下可激活VanA、VanH和VanX共轉錄所需的起動子，VanY基因和VanZ基因編碼生成輔助蛋白VanY和VanZ。VanY是一種D，D－縮肽酶，可解離肽聚糖前體的D－丙氨酸，但需由VanX共同參與。VanZ可能與肽可黴素低度耐藥有關，具體機製不清。
在屎腸球菌、糞腸球菌、鳥腸球菌、耐久腸球菌和堅忍腸球菌等也已檢出高水平耐糖肽類菌株。實驗中發現，這些高耐藥菌株可通過接合從糞腸球菌向金黃色葡萄球菌轉移。例如發現一株耐萬古黴素的鳥鏈球菌攜帶與VanB連接酶相關的基因。
獲得性耐藥中的另一表型為VanB型，其耐藥菌株主要包括屎腸球菌和糞腸球菌，腸球菌對萬古黴素呈不同水平的耐藥性，而對肽可黴素敏感。VanB型耐藥可以轉移，耐藥基因存在於質粒或染色體上，轉移可能與轉座子有關。VanB型耐藥株產生39.5kD的蛋白質與VanA有77％氨基酸同源性，編碼轉座子是Tn1547，包含VanB基因；其耐藥機製的生化基礎及編碼的基因與VanA型相同，細胞壁前體的D－丙氨酸－D－丙氨酸同樣被D－丙氨酸－D－乳酸取代，存在VanHB脫氫酶、VanB連接酶和VanXB二肽酶。VanB菌株含輔助基因VanW，其具體作用機製不清，但不包括VanZ基因。此外，有些腸球菌對糖肽類抗生素呈天然耐藥，主要表型為VanC型腸球菌，包括鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌和微黃腸球菌，其對萬古黴素呈低水平耐藥，耐藥基因可能存在於染色體上，細胞壁前體由VanC連接酶催化合成D－丙氨酸－D－絲氨酸，使其與萬古黴素的親合力下降。VanC基因又分為VanC1、VanC2和VanC3。臨床已有報道金黃色葡萄球菌對萬古黴素產生中介耐藥，但具體機製還不很清楚。
三、細菌的耐藥基因檢測：
（一）耐苯唑西林葡萄球菌基因的檢測：如前所述MRS可由mecA介導，也可有高水平的β內酰胺酶或含因修飾致對苯唑西林親和力降低的PBP。通過基因檢測出高水平β內酰胺酶而無mecA基因，即可指導臨床醫生用藥。
（二）肺炎鏈球菌β內酰胺耐藥基因的檢測：目前編碼革蘭陰性菌中的TEM、SHV、OXA、CARB和ROB等β內酰胺酶的基因的DNA探針和PCR引物已能合成，故可用基因檢測方法檢測。醫院感染中肺炎克雷伯菌等其他腸杆菌科可產生ESBL和其他能水解頭孢噻肟、頭孢噻甲羧肟和氨曲南的酶，現在已采用等電聚焦電泳作為鑒定新的β內酰胺酶基因的篩選工具，DNA測序為分析新的β內酰胺基因的“金標準”。
（三）氯黴素耐藥基因的檢測：編碼氯黴素乙酰轉移酶的基因CATs存在於革蘭陰性和陽性菌中，介導氯黴素耐藥，檢測CAT的探針有catⅠ、catⅡ、catⅢ，但這些探針的特異性尚未肯定。檢測革蘭陽性厭氧菌如產氣莢膜梭菌和艱難梭菌的catP、catQ和catD則具有較強的特異性。
（四）糖肽耐藥基因的檢測：腸球菌耐藥性有幾種不同的基因，包括vanA、vanB、vanC1、vancC2、vanC3、vanD等，檢測上述基因的DNA探針和PCR方法已有報道。日本、美國還報道了對糖肽類抗生素敏感性降低的金黃色葡萄球菌，由於耐藥機製不清，目前尚未有相應的基因檢測方法。
（五）大環內脂、林可黴素和密柑黴素耐藥基因的檢測：紅黴素甲基酶基因（erm）介導耐大環內脂類、林可黴素和密柑黴素為MLS耐藥表型；msrA基因僅介導對大環內脂類和密柑黴素耐藥為MS耐藥表型；mefE為大環內脂類抗生素泵出基因，目前已能用DNA探針和PCR分析法檢測上述基因。MsrA基因常見於金黃色葡萄球菌株，其表型耐紅黴素，但對氯潔黴素敏感。肺炎鏈球菌耐紅黴素常由mefE基因介導。由於大多數耐紅黴素的葡萄球菌菌株同時耐氯黴素，因此當必需選用氯潔黴素治療時，msrA探針和PCR分析法可判定是存在msrA還是ermA以輔助選藥。
（六）喹諾酮耐藥基因的檢測：喹諾酮耐藥的兩大主要機製為：靶粒改變――細菌的促旋酶（由gyrA和gyrB編碼）和拓樸酶（由parC和parE編碼）改變；藥物主動泵出，限製到達靶粒的藥物量。耐藥常與gyr和par位點突變相關。目前DNA探針還不能可靠地檢測位點的變化，PCR技術擴增後測定gyrA、parC和parE基因的核苷酸序列有助於檢測對喹諾酮的耐藥性。
（七）磺胺耐藥性基因的檢測：與之相關的耐藥基因有sulⅠ和sulⅡ，這兩個基因都已克隆、測序，並已有探針合成，但尚未在臨床中使用。sulⅠ基因常與可轉移DNA元件如Tn21連在一起，它能介導多種耐藥基因在細菌間傳遞。因此sulⅠ基因常可作為革蘭陰性菌多重耐藥的指針。
（八）四環素耐藥基因的檢測：四環素耐藥至少可由15 種不同基因介導，如tet（A）、tet（B）、tec（C）、tet（E）、tet（F）、tet（H）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（N）、tet（O）、tet（Q）、和tet（S）。其中tet（M）擴散最廣，包括葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌；革蘭陰性杆菌如彎曲菌屬、陰道加德納菌、支原體、解脲支原體和淋病奈瑟菌。現已能合成tet（M）、tet（O）和tet（Q）的PCR引物。PCR檢測有助於判斷牙周疾病用四環素治療的療效。
（九）三甲氧嘧啶耐藥基因的檢測：細菌中介導TMP耐藥基因（dhfr）數量不斷增多，雖然目前尚未找到所有dhfr基因都相同的一致性序列，但是DNA探針仍是檢測及分類新甲氧苄啶耐藥基因（dhfr）的有力工具。流感嗜血杆菌中現又發現了一新的TMP耐藥基因folH。
（十）分枝杆菌中耐藥性基因的檢測：多重耐藥結核分枝杆菌的出現，嚴重地威脅著人類的健康。目前已經能用PCR分析法檢測結核分枝杆菌rpoB位點變異，該變異與利福平耐藥相關。PCR－SSCP分析能可靠地鑒別利福平敏感株和利福平耐藥株。結核分枝杆菌中，利福平耐藥也可作為多重耐藥的標記。檢測麻風分枝杆菌利福平耐藥性的PCR引物也已能合成。KatG和inhA基因位點與異煙肼耐藥相關，可通過PCR－RFLP分析和PCR產物的DNA序列分析來檢測。
四、自動化儀器細菌耐藥性檢測應用：
檢測細菌耐藥機理是當今細菌學的一個最重要的課題，也是正確指導臨床醫生合理使用抗生素的重要依據。VITEK－2是最新一代的細菌自動快速鑒定及藥敏分析係統，圍繞臨床治療效果和快速鑒定藥敏結果這一重點，高級專家係統確認鑒定和藥敏結果的一致性。高級專家係統是目前微生物分析係統向高智能化技術邁進的一大突破，收集了全球超過十萬份的權威論著，數據庫中含有20000個MIC分布圖和2000種耐藥表型，專家庫裏收集了對常見致病菌有治療作用抗生素的MIC分布圖，通過與資料庫中的MIC分布圖相比較，對細菌生物學進行確認，並確認耐藥表型，確定鑒定與藥敏結果的一致性，快速準確地分辨細菌的耐藥機製，耐藥表型和基因型，如PBP改變、ESBL TEM或SHV或PER、氨基糖苷類耐藥APH（2’）+AAC（6’）、氨基糖苷類耐藥APH（3’）－Ⅲ、ANT（4’）（4’）、四環素類耐藥外排（TET K）、靶位改變（TET M），MLSB固有耐藥及MLSB誘導耐藥等，對耐藥趨勢發出警告或修改藥敏結果，提供臨床用藥資訊，確保臨床療效。以前微生物實驗人員隻能看藥敏結果給醫生提供用藥建議，對臨床醫生提出的問題和不同意見，無法給出令人信服的解釋，造成臨床與微生物實驗室溝通困難；VITEK－2高級專家係統不僅微生物實驗人員可不斷學習其細菌學知識和抗生素藥理知識，更重要的是顯著提高藥敏檢測的質量，提高臨床治療效。
作者：方曉霞 福建省龍岩市第一醫院 364000
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