病原微生物分子分型技術研究進展

現代分子分型技術主要包括質粒DNA圖譜分析、限製性內切酶消化後的染色體DNA分析、核酸探針雜交、脈衝場凝膠電泳(PFGE)、PCR和多位點序列分析(MLST)技術。DNA重複序列PCR技術(Rep-PCR)的實用性強、低用費、可再現性好，可用來進行普查工作。PFGE技術分辨力高，是病原微生物分子分型的最佳選擇。而有更高分辨力和再現力的MLST新技術正在逐漸被使用。這些分子分型技術將有助於在全球範圍內進行病原微生物流行病學研究。本文對近年來常用的病原微生物分子分型技術的研究進展作一綜述。

　　1   評估分型技術標準的可行性

　　評估一項分型技術是否可行的標準有2個：完成標準(有效性)和便利標準(效率性)。完成標準包括分型能力、分辨力和分型技術間的一致性，而便利標準包括通用性、快捷性、解釋和執行的容易程度。一項分型技術的分型能力意味著通過這項分型技術，分離株被劃分為所屬類型的比例。再現性是指通過這種技術對同種樣品在重複檢測時，產生相同結果的能力。分辨力是指擁有一致的或非常相似的相關圖譜的分離株事實上具有相同的傳播途徑的可能性。2種分型技術的一致性通過使用這些技術把高度相似的分類株分組歸類而被評價〔1，2〕。因此，對一種分型技術來說首選標準是有效性〔3〕。當應用於細菌病原菌時，一種分型技術必須要有效率性優點。通用性就是用於任何病原菌的能力，這對於醫源性病原菌感染的研究是一個非常重要的優點。操作和解釋結果的容易度以及所需費用、試劑和儀器的可行性都是選擇一項分型技術的重要標準〔2-4〕。

　　2   現代分子分型技術

　　21   質粒DNA圖譜分型技術   細菌質粒分析是較早被使用的對病原微生物流行病學進行調查的分子分型技術〔4〕。這種技術包括萃取質粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。這是一種容易操作和理解的技術。由於不同菌株質粒DNA序列和大小不同，通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也將不同，因此，與流行病相關的分離株能夠被分類分型。質粒圖譜分析的再現性和分辨力可通過限製性內切酶消化質粒而提高。支持這個方案的理論是，雖然2個不相關質粒有相同的分子量，限製性內切酶位點的位置和頻率是不同的。但此技術也有應用局限，質粒是可移動的非染色體遺傳物質，細菌能自發的失去或很容易的獲得，結果流行病相關的菌株可以展示不同質粒指紋圖譜。許多質粒帶有抗性決定因子的基因，存在於轉位子上，而轉位子很容易丟失或獲得，這同樣可以迅速改變質粒DNA組成。產生圖譜的再現性也會由於質粒空間存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線形的)而被影響，而凝膠電泳時具有不同遷移速度。大多數病原微生物有質粒，但沒有質粒的就不能用此技術分型。此外，由於有些分離株中含有1個或2個質粒，會使菌株間的分辨力降低〔4〕。

　　22   染色體DNA限製性內切酶分析技術   染色體DNA經限製性核酸內切酶消化，消化後的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限製性內切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA，因為它們對染色體上的酶切位點非常敏感，可以產生大量短的片段。電泳後，將獲得一係列被分離的DNA圖譜。通過比較圖譜，就可以進行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過這種方法分型，但由於基因組DNA巨大，酶切後產生的片段眾多，且含有大量的重疊片段，這將導致菌株間圖譜一致性分析產生困難〔4〕。

　　23   核酸探針雜交技術   用高效率的限製性內切核酸酶消化染色體DNA後，染色體就被分解成一係列不同大小的片段，具有一定的片段長度多態性。由於片段太多(包括上述的重疊片段)，給分型帶來困難。這種分型困難可以通過印跡雜交解決。有報道，以印跡法為基礎的針對金黃色葡萄球菌進行分型研究的2次分型法〔4〕，首先是通過金黃色葡萄球菌染色體DNA隨機擴增而製備一些探針，再使用幾株菌檢驗探針的特異性，並選擇出有效的探針。使用2次篩選到的探針與分離株進行雜交，根據是否雜交，對分離株進行分型，效果良好。

　　24   染色體DNA的脈衝場凝膠電泳分型技術   PFGE分型技術是〔5〕使用對染色體有很少酶切位點的限製性核酸內切酶消化細菌DNA，產生大的DNA片段(10～800kb)，這些大片段不能通過常規電泳方法進行有效分離。在電場方向周期改變(脈衝)的凝膠電泳條件下，DNA片段根據大小有效分離。PFGE產生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限製性內切酶產生的圖譜更為簡單清晰〔6〕。理論上，所有的細菌都能使用PFGE進行分型分類，結果具有極高的再現性和分辨率，鑒於PFGE技術的一係列優點，一些人把其視為一種理想的分型技術，並推薦作為對金黃色葡萄球菌等病原微生物分型的最優標準技術〔4〕。使用PFGE也有一些局限，例如所需時間長，使用的試劑非常昂貴，要求專門的儀器等。另外，很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離，使用不同凝膠進行電泳得到的結果也比較複雜，這為不同實驗室間的結果比較帶來一定麻煩〔7〕

　　25   聚合酶鏈反應技術   聚合酶鏈反應(PCR)是一種高靈敏度的體外擴增DNA片段的技術，近年來在病原微生物分型研究上也得到了廣泛應用。而且，科學家根據微生物基因組特點及分型工作的需要，對PCR技術進行了一係列的改良，使其成為了快速、簡捷的分型技術。目前，常用的PCR分型技術有隨機擴增的多態性DNA技術(RAPD)和重複序列PCR技術(Rep-PCR)。RAPD是一種典型PCR衍生技術，用一係列任意的核苷酶序列(10個堿基)作為引物，通過引物與模板DNA序列隨機配對進行PCR擴增。由於引物較短，所以退火溫度要求較低。擴增時隻有距離最近、方向相反的2個引物之間的模板DNA區段才能被擴增。因此，基因組在這些區段如發生了DNA片段缺失、插入或堿基突變，就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化。通過電泳對擴增產物DNA片段的多態性進行檢測、分析就可以反應出不同菌株基因組的DNA特點，從而對他們進行分型。RAPD技術的使用範圍也非常廣，分辨結果也有較好的實驗室再現性。與其他技術相比，這種技術的優勢是它的簡便性和快捷性。分辨力依靠引物的數據和核苷酸序列而改變。使用單引物具有低分辨力，但是使用3個或3個以上引物時，會使獲得最終結果所需時間大大減少〔8，9〕。雖然RAPD的分型結果在不同實驗室間變化較大，分辨力不如PFGE技術，但在疾病暴發流行時，PAPD仍是一種分析相關菌株和排除不相關菌株的良好技術〔10〕。Rep-PCR技術是利用細菌基因組中廣泛分布的短重複序列為引物靶序列，進行PCR擴增，通過對PCR產物電泳結果的比較，分析菌株間基因組存在的差異〔11〕。這些重複序列在原核生物界廣泛存在，這一些細菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中，光譜帶的大小和數量的不同代表著不同菌株重複序列間的距離和重複序列的數量，該技術對於大量或少量的菌株分型均適用，簡單易行。與其他分類技術相比，這種技術有更高的分辨力。研究表明，雖然有時Rep-PCR分辨力稍低，但與PFGE獲得的結果確有很好的關聯度。最近已經有人把Rep-PCR與其他已經用於菌株分類的基因分型技術相比較。分析結果顯示，Rep-PCR與RAPD和PFGE有相同的分辨力〔12〕。與RAPD相比，Rep-PCR在DNA提純中需要一額外步聚。因此，RAPD技術比Rep-PCR稍微簡單快速。然而Rep-PCR技術的再現性非常好，這是RAPD無法比擬的。與PFGE相比，Rep-PCR主要的優點是操作中簡便和快捷。而再現性PFGE相似。

　26   多位點序列分型技術   多位點序列分型技術(MLST)源於多位點酶凝膠電泳技術(MLEE)〔12〕，MLEE屬於表型分型技術，涉及到能進行選擇性染色的蛋白電泳技術。首先，把要研究的蛋白質從生物體中萃取出來，用電泳分離，隨後選擇性的染色。根據遷移率，每條光譜帶都反應了相應的蛋白質基因類型。不同位置相同蛋白質的2條光譜帶反應出2種不同構象的不同蛋白質，因此，是同一個基因的等位基因。MLEE有一個明顯的缺點即特殊位點的堿基序列不能直接的通過分析這個位點的表達產物而推斷。因為2個不同基因序列可以表達具有相同遷移率的2種蛋白質，它們將會在MLEE中被檢測為同1條帶。MLST技術解決了這個問題。使用MLST技術，不分析基因的表達產物，而是分析基因的核苷酸序列。1個基因突變後，形成不同的核苷酸序列，將明確被認定為是這個基因的等位基因。使用MLST技術時，對於每個菌株都要選擇一定的核甘酸位點，這些位點通常位於持家基因內部片段之內，片段長度約500bp序列。選擇持家基因是由於在待測菌株中，它們通常肯定存在，並有足夠的變異度來適合在這些位點產生變異的等位基因的存在。已經有人使用PFGE方法證實了MLST技術對金黃色葡萄球菌分型的有效性。他們發現用MLST技術分為1組的各個菌株具有相似的PFGE圖譜，相反用MLST技術得到的不同菌株具有顯著不同的PFGE圖譜〔5〕。MLST的絕對分辨能力可超過20×109個等位基因圖譜。通過等位基因圖譜定義的菌株類型由不多於7個的1串數字組成，這種信息是清晰的並且很容易在全球通過電子媒介傳達。而且，那些難以計數的圖株類型的等位基因圖譜可以通過互聯網很容易的被商議和統一，從而使全球的流行病學數據標準化〔13〕。MLST的缺點是它的高額費用和操作過程所需的特定儀器。這使得這項技術隻能局限在大型的全球性流行病學研究中心使用，影響其在醫院推廣普及。

　　3   小結

雖然標準的解釋Rep-PCR圖譜的要點還沒有最終確定，但是它具有的高分辨力、簡單易行和良好的可再現性等特點，還是決定了它在目前以及今後一定時間內是最佳的病原微生物分子分型技術，尤其在缺乏專業儀器設備的實驗室(如不能進行PFGE技術和DNA測序工作的實驗室)，以及疾病暴發流行的譜查階段，它將是首選的技術。PFGE技術雖然耗時長、技術複雜，但確是一種能獲得最佳分型結果的技術，有效地強化它的再現性。由於它所使用的儀器相對便宜，PFGE的使用將會普及，並被用來解決其他簡單分型遺留的不足。長期以來，找到一種有足夠分辨力的技術區分與流行病相關的菌株是一項技術難題。解決這個難題的方法是在一項研究中使用一種以上技術，一種技術的缺點會被其他技術的優點所代替。分子分型技術對於病原微生物分型是非常有價值的手段，將得到更加廣泛的推廣使用。

作者：李雪 金莉莉 王秋雨《中國公共衛生》

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