應用微生物改良法測定紅細胞葉酸的研究

  摘 要  目的:研究微生物改良法測定紅細胞葉酸（RCF）的可靠性。方法:用本方法檢測不同疾病患者100例和健康自願者50例的紅細胞葉酸含量。對高、低兩個質控標準的精密度、穩定性及實驗相關性等指標進行評價。結果:本方法化學性能的評價表明:批內變異係數為2.228%和3.620%，批間變異係數為5.12%和7.51%。各廠家的試劑相關性良好（r=0.9544，n=50）。50名健康自願者測定結果表明RCF的正常參考值為586.3±69.6ng/mL。結論:本方法測定結果準確、可靠且操作簡便，實驗條件簡單，適宜於推廣。

    關鍵詞  紅細胞葉酸;微生物改良法;巨幼細胞貧血

    血液中的葉酸水平異常偏低，除與葉酸缺乏的巨幼細胞貧血有關外，還與胎兒神經管缺陷有關，引起同型半胱氨酸血症，可影響血管功能和增加卒中危險。因而血液中的葉酸水平的檢測受到高度重視。測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結合兩類，我們用微生物改良法對紅細胞葉酸（RCF）進行了初步的研究。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1  菌株製備:購買耐氯黴素乳酸菌（NCIMB10463）凍幹菌株。將凍幹的菌株懸浮於5mL保養液37℃孵育18h後;混勻取1滴加入新的5mL保養液，37℃孵育18h（該菌株可以在-4℃保存2W，用於菌株的繁殖）後;混勻取0.5mL加入5mL保養液，37℃孵育6h後;用生理鹽水清洗5次，最後用5mL生理鹽水懸浮（簡稱清洗後6h菌株）。

    1.1.2  測量液:按培養基2.35g，氯黴素0.02g，V-C0.1g，Tween-80（1∶10稀釋）0.1mL，去離子水100mL的比例配製，以5mL為單位分裝。

    1.1.3  保養液:每升測量液中加標準葉酸10mL，按5mL/支分裝於無菌帶塞試管，置-20℃可保存1年。標準葉酸濃度:10ng/mL。

　　 1.3 測定樣本

    ①定值高值質控標準=2.252ng/mL，低值質控標準=1.761ng/mL;分裝後於-70℃保存，保證質控標準隻凍融1次。②病人標本，不同疾病患者100例及健康自願者50例，年齡25歲～40歲。所有標本均空腹，采肘靜脈血2mL～3mL，置EDTA幹燥管內，按1∶10比例稀釋在1%的V-C液中（稱V-C血）於-20℃貯存。

    2 微生物測定法

    2.1.  按表1和表2操作配製孵育試管。表1 標準曲線管孵育前配製表2 紅細胞葉酸標本孵育前配製

    2.2.  上述試管在37℃孵育18h後，搖勻，用721-分光光度計（在波長λ=660mm處）比濁。以葉酸濃度為橫軸，以光密度值（OD值）為縱軸做出標準曲線。試管1和試管2的OD值首先扣除同濃度空白對照管的OD值，然後由標準曲線查出該試管的葉酸值，標本的V-C血RCF（ng/mL）=（試管1葉酸值×0.04+試管2葉酸值×0.02）/2。標本的紅細胞葉酸值（RCF）按以下公式進行計算:RCF（ng/mL）=［（V-C血RCF×10）/紅細胞壓積］ng/mL。

    3 結果

    3.1 精密度實驗

    取高、低值質控血清，平行測定20次，計算批內CV，低值血清CV=2.228%，高值血清CV=3.620%。連續測20d，計算批間CV，低值血清CV=5.12%，高值血清CV=7.51%。

　　 3.2 穩定性實驗

    按照菌株製備方法將凍幹的菌株打開後，測定並繪製標準曲線圖，測定高值、低值質控的RCF值;同時用保養液使菌株長期保存。並分別在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保養液的菌株繪製標準曲線圖，測定高值、低值質控的RCF值。高值質控的CV=5.18%、低值質控的CV=3.03%。

3.3 相關實驗

    取50份標本同時用本法與美國DPC公司提供的進口的葉酸（固相非煮沸雙相計數）放免試劑盒對RCF進行測定，相關係數r=0.9544。 3.4 正常參考值

    選取50名年齡在25歲～40歲健康人標本用本方法進行紅細胞葉酸測定，用平均值±兩個標準差的方法進行統計計算正常參考值，測定結果表明RCF的正常參考值為（586.3±69.6）ng/mL。

    4 討論

    葉酸在體內代謝極為重要的單碳轉運中起著關鍵性作用。血液中的葉酸缺乏除與巨幼細胞貧血有關外，還與胎兒神經管缺陷有關，引起同型半胱氨酸血症［1］ ，可影響血管功能和增加卒中危險 ［2，3］ 。由於紅細胞內所含葉酸濃度比血清所含

    葉酸濃度高10倍～20倍，因而紅細胞葉酸比血清葉酸更能代表組織內葉酸水平，當組織內葉酸水平已經缺乏，但尚未出現巨幼細胞貧血時，紅細胞葉酸的測定對葉酸缺乏作出的決定更有價值 ［4］ ;而且血清葉酸的結果易受多種因素的影響，如:炎症、肝病、腫瘤等 ［5］ 。因此雖然血清葉酸降低代表早期葉酸缺乏，但紅細胞葉酸減低，不受外來因素的影響，確實反映了組織葉酸水平的減低。

測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結合法兩類，後者操作簡單、靈敏、但是價格昂貴，目前國內多數用於測定血清葉酸（SF）。當肝腎功能受損時，葉酸可以聚合。這種聚合體用競爭結合法不能測定（除非這種聚合被解開）;但微生物改良法可以測定血液中總葉酸值（包括上述聚合體），因此用微生物改良法能滿足臨床測定肝、腎受損病人的總葉酸值。微生物改良法是經典的方法，材料來源廣泛，並且用保養液可以使菌株長期保存。如果保存不當，致使菌株受雜菌汙染或死亡，可以重新購買凍幹菌株，十分簡單便利地重新建立該實驗;不需要購買特殊儀器;對儀器和實驗條件要求較低;適用於大批標本測定。本實驗觀察了長期保存的菌株，其實驗穩定性良好;與美國DPC公司提供的進口的葉酸（固相非煮沸雙相計數）放免試劑相關性顯著。因此便於在臨床上推廣使用。

作者：李建蘭 楊波 冉家彥《長治醫學院學報》

    參考文獻

    ［1］ Siri PW，Verhoef P，Kok Fj.Vitamin B6，B12a and folate:Associ-ation with plasmatotal homocysteine and risk of coronary at herosclerosis［J］.J Am Coll Nutr，1998，17（5）:435～441.

    ［2］ Robinson K，Arheart K，Refsum H，et al.Low circulating folate and vitamin B6concentrations:risk factors for stroke，peripheral vascu-lar disease，and coronary artery disease［J］.Circulation，1998，97:437～443.

    ［3］ Morrison HI，Schaubel D，Desmeules M，et al.Serum folate and risk of fatal coronary heart disease ［J］.JAMA，1996，275:1893～1896.

    ［4］ Hill PW.Evaluntion of a commercial radioisotopic kitfor folate as-says.J Clin Pathol，1977，30:449.

［5］ 楊慧敏，陳覺凝，餘靈，等.82名正常兒童紅細胞葉酸、堿性鐵蛋白水平測定及臨床意義.中國小兒血液，1998，3:260.

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