幽門螺杆菌耐藥的分子機理研究進展

幽門螺杆菌（helicobacter pylori，HP） 與胃、十二指腸疾病密切相關，是消化性潰瘍、慢性活動性胃炎、十二指腸球部潰瘍重要致病因素，也是胃癌演變的始動因子，與胃淋巴瘤的發生、發展有一定的關係［1］。HP清除直接關係到上述疾病的轉歸。但隨著抗生素的廣泛應用，其耐藥率逐年上升。因此，探討HP的耐藥分子機理，對指導臨床合理用藥，有效控製HP相關疾病的傳播有著十分重要的意義。

　　1  HP耐藥性的產生   

　　治療HP感染的藥物有咪唑類如甲硝唑，大環內酯類如克拉黴素，β-內酰胺類如阿莫西林、喹諾酮類、四環素與硝基呋喃類等。關於HP耐藥的起源，現代微生物學認為有兩種可能性：①自發突變學說，即耐藥性的產生是由於菌株的自發突變。根據達爾文的進化論，隨著抗生素的應用，抗生素敏感的細菌逐漸減少而耐藥菌逐漸增多；②耐藥遺傳信息的傳遞產生了新的耐藥株。染色體DNA 或質粒基因上有控製耐藥性的遺傳信息，HP耐藥基因在細菌DNA重組時進入敏感菌株，從而使耐藥菌株增加。

　　2  HP耐藥的分子機理   

　　細菌對抗生素的耐藥可能與菌種的特性有關，也可能通過菌株的變異或者基因的轉移獲得，後者主要涉及到：①細菌產生滅活酶或鈍化酶；②藥物作用的靶位改變；③細胞膜的滲透性改變；④細菌對藥物的外排和生物被膜的形成。HP對不同抗生素的耐藥主要與以下機理有關：

　　2.1  HP對甲硝唑的耐藥  甲硝唑是一種具有抑菌活性的藥物前體，由於其氧化還原電勢較低，易被硝基還原酶還原為亞硝基衍生物、羥氨衍生物，還原產物具有細胞毒性，使細菌DNA降解、斷裂甚至導致細菌死亡。因其殺菌活性不受胃內低pH的影響，在胃腔內濃度高，具有較強的抗HP活性，因此常用於HP感染的一線治療。但是近年來，隨著甲硝唑的廣泛使用，HP對甲硝唑的耐藥率逐年上升。在發達國家HP對甲硝唑的耐藥率為20％～30％，而發展中國家高達60%～80%［2，3］。HP對甲硝唑耐藥主要與rdxA基因突變導致該基因的失活有關，rdxA是編碼氧不敏感的煙酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸硝基還原酶基因。但Kwon，Marais［4，5］研究證實frxA、fdxA、fldA、fdxB、oorDABC和porCDAB等基因也參與了HP對甲硝唑的耐藥，並證實frxA、fdxB 和rdxA 基因的失活不會對HP產生致死效應，而fdxA、fldA、oorDABC 和porCDAB基因的失活卻會導致HP的死亡，這可能與這些基因編碼的蛋白為HP的存活提供了一個微需氧環境有關。同時也發現單一fdxB基因突變導致HP對甲硝唑的低水平耐藥甚至不導致耐藥，但當rdxA 基因與fdxB聯合突變時將導致高水平耐藥，而frxA或rdxA 基因的突變均會產生中等水平耐藥，但當兩者同時突變時則產生高水平耐藥。國內李耿等［6］研究也表明HP對甲硝唑耐藥不僅與rdxA有關，同時與frxA、fdxB基因突變有關。

　　2.2  HP對克拉黴素的耐藥     克拉黴素又名6-甲氧紅黴素（甲紅黴素），屬於新一代大環內酯類藥物。HP對克拉黴素的耐藥率地區差異明顯，各國為1%～13%不等。Glupczynski等［7］發現，兒童對克拉黴素的耐藥率比成人高，這可能與兒童免疫力較成人低，而克拉黴素經常用於兒童呼吸道感染的治療有關。HP對克拉黴素的耐藥主要為23 SrRNA可變區基因的突變導致核糖體變構，克拉黴素結合位點隨之發生改變，進而使HP與克拉黴素的親合力減弱，不能阻止細菌的蛋白質合成，從而產生耐藥性。但23 SrDNA的突變位點和突變形式卻具有地區差異［8，9］。如中國東北地區，突變以G2224A，C2245T和T2289C為主，北京地區突變主要為A2143G［10］，上海地區突變在2144位。但總的來說，A2143G的突變最為常見且穩定，占突變的45.12%～82.11%，其它的突變形式有G2141A、A2142G、A2142C、A2142T、A2143C、G2115A，甚至在染色體的其它區段也發生突變。Fontana［11］等用PCR檢測了12株耐克拉黴素菌株均未發現23 SrRNA基因上的2142位點和2143位點突變，卻發現有7株耐藥菌在23 SrRNA的恒定區發生了T2717C的突變，引起低水平耐藥（MIC=1μg/ml）。

　　2.3  HP對β-內酰胺類藥物的耐藥      常用於抗HP 的β-內酰胺類藥物為阿莫西林。β-內酰胺類藥物是通過與細菌內膜靶蛋白青黴素結合蛋白（penicillin  binding proteins，PBPs）結合，使轉肽酶失活，破壞細菌細胞膜的完整性，使細菌死亡。HP對阿莫西林的耐藥率相對較低。以往研究認為，細菌對β-內酰胺類藥物的耐藥機理是：產生β-內酰胺酶、產生新的PBPs、藥物作用PBPs的位點改變、細菌的滲透性降低以及自溶酶減少等。但是HP耐藥菌株尚未檢測到β-內酰胺酶，故推測HP對阿莫西林的耐藥可能與其它機理有關。目前，已發現3種高分子量PBPs（PBP1、PBP2、PBP3）和6種低分子量PBPs，其中PBP1A上轉肽酶結構域的4個氨基酸突變引起HP對阿莫西林低水平耐藥（MIC<8μg/ml）［12］，PBP1A羧基端編碼青黴素結合位點的10個氨基酸突變和細胞膜通透性改變，引起HP對阿莫西林中、高度耐藥（MIC≥8μg/ml）［13，14］。Dore［15］研究也發現PBPs2D缺失是HP對阿莫西林耐藥的原因。也有報道［12］，在阿莫西林耐藥菌株的保守片段有4個PBP1的突變（S414R，Y484C，T541I和P600T）和1個PBP2突變（T498I），其中PBP2單獨突變不能引起耐藥，而PBP1單獨突變能引起耐藥，而兩者一同突變並不能增強其耐藥性。還有學者［14］認為多點突變可以導致耐藥菌株的產生，Okamoto T［14］發現在兩株突變菌株PBP1中的ORF（開放閱讀框）都有4個氨基酸殘基被替代和一個氨基酸殘基的插入。

　　2.4  HP對喹諾酮類藥物的耐藥      喹諾酮類藥物容易產生耐藥，較少用於HP根除治療。其耐藥主要與DNA旋轉酶（GYR）的改變和拓撲異構酶Ⅳ有關。DNA旋轉酶由gyrA基因編碼的2個A亞單位和gyrB基因編碼的2個B亞單位組成的四聚體。此酶的主要功能是鬆解超螺旋DNA，使之能複製。對大腸埃希菌的研究發現，細菌對喹諾酮類的高度耐藥由gyrA的突變引起，而低度耐藥由gyrB突變引起。在對HP耐藥菌株中也發現，gyrA基因有4個位點發生突變（Asn87→Lys、Ala88→Val、Asp91→Gly、Asn或Tyr取代、Ala97→Val取代），同時把耐藥菌株的gyrA片段導入敏感菌株中從而使敏感菌株獲得耐藥性。因此，推論gyrA基因的突變是HP對喹諾酮類藥物耐藥的分子基礎。

　　2.5  HP對利福黴素類藥物的耐藥  利福黴素類藥物常用於抗結核病治療，較少用於HP的治療，該類抗生素對細菌的作用靶位是依賴DNA的RNA聚合酶，此酶由rpoB基因編碼。Heep［16］經過一係列體外篩選獲得了HP ATCC43504耐藥株，對rpoB基因克隆、測序進行突變分析，發現所有耐藥突變均包含密碼子524-545和密碼子586在內的基因簇區域。並發現利福平耐藥株與野生型rpoB基因相同，隻是在擴增54-916堿基對時，有一個密碼子的改變，即V149→F。從耐藥株擴增的rpoB基因片段導入到敏感株中，在選擇培養基上長出了耐利福平的HP。從而推論，HP對利福黴素的耐藥與rpoB可能有一定的關係。但確切的機理有待進一步研究證實。

　2.6  HP對四環素的耐藥  四環素因其價廉有效而用於HP感染治療，但近年來發現該藥易引起二重感染，且其耐藥率也呈上升趨勢，現較少用於臨床。四環素主要作用於細菌核蛋白體，阻止mRNA核蛋白體複合物A位與氨基酰tRNA的結合，從而抑製始動複合物的形成及肽鏈的延伸，並阻止核蛋白體與終止密碼結合，抑製已合成的肽鏈或蛋白質釋放。16 SrRNA的突變是HP對四環素耐藥的主要原因，其中最常見的突變為16 SrRNA AGA（965～967）→TTC的突變。Nonaka等［17］證明16 SrRNA 965-967位，單個、兩個或者三個堿基的突變都會導致HP對四環素的耐藥，Wu JY等［18］也證明54%耐藥菌株是單一位點突變（如CGA、GGA、TGA、AGC、AGT），這可能是由於這些堿基的改變，影響了16 SrRNA的結構所致。Lawson等［19］在1006株分離菌株中發現18株對四環素敏感性降低，其中有3株耐藥（MIC≥4mg/L）；敏感性降低的18株中有10株檢測到16 SrRNA突變：一株存在A926T和A928C的雙重突變，一株A926C突變，一株A928C突變，另外七株為A926G突變。

　　3  結語   

目前，雖然對HP的耐藥性有所研究並取得了一定的進展，但仍存在著許多問題，如耐藥機理的不確定性；抗生素的使用劑量、用藥史、年齡、性別等在HP對抗生素耐藥中的確切作用仍不清楚。因此，加強臨床菌株的耐藥性研究，深入探討HP耐藥機理與特性，為指導臨床合理用藥以及抗生素的開發提供了新的思路。

作者：喻海忠，許國瑩，陳巧林，陳建國，蘇兆亮《右江民族醫學院學報》

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