【摘要】 目的：通過觀察空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經節細胞上的結合，初步探討空腸彎曲菌抗體影響結腸神經節細胞發育，導致神經節細胞變性的可能性。方法：取正常結腸標本60例，隨機分為實驗組和對照組，免疫組織化學方法處理。實驗組利用空腸彎曲菌抗體作用於正常結腸神經節細胞，觀察抗體與神經節細胞的結合情況；對照組利用PBS液代替空腸彎曲菌抗體，其他同實驗組。比較兩組空腸彎曲菌抗體的結合有無不同。結果：空腸彎曲菌抗體可以和正常結腸的神經節細胞結合，結合的陽性率為83.3%。實驗組和對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：空腸彎曲菌抗體可與神經節細胞結合，可能影響神經節細胞發育及導致神經節細胞變性。
【關鍵詞】 彎曲菌•神經節•腸神經元發育異常
腸神經元發育異常（neuronal intestinal malformations，NIM）是小兒外科常見的消化道神經發育畸形，包括先天性巨結腸（Hirschsprung’s disease，HD）和巨結腸類緣病（allied disorders of Hirschsprung’s disease，ADHD），其基本的病理病因是神經元發育異常導致正常神經節細胞減少或者缺如。而某種或某些細菌、病毒可能是影響腸神經節細胞發育、甚至變性壞死因素［１］。研究表明空腸彎曲菌感染可以導致外周神經係統的損傷如格林-巴利綜合征［２-３］。由於空腸彎曲菌容易傳染，因而被認為是全世界導致細菌性腹瀉的主要原因之一。空腸彎曲菌感染後廣泛存在於腸道，能損傷結直腸，存在導致腸神經節細胞損傷的可能。本研究通過檢測空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經節細胞的結合情況，初步探討空腸彎曲菌影響神經節細胞發育、甚至變性壞死的可能性。
1 資料與方法
1.1 一般資料 收集2005年7月—2006年7月於山東大學第二醫院小兒外科行結腸造瘺、腸梗阻、腸代膀胱手術切除結腸的60例患兒臨床資料，其中男36例,女24例。年齡4個月~4.5歲,平均年齡（2.33±1.93）歲,所有患兒結腸標本術後病理組織學證實神經節細胞正常。所有標本隨機分為實驗組、對照組，每組30例。
1.2 免疫組織化學方法 組織標本10%甲醛固定，常規石蠟包埋後進行鏈酶親和素-辣根過氧酶免疫組織化學染色，4 μm切片脫蠟至水，實驗組加入兔抗人空腸彎曲菌IgG（杭州聯科生物技術有限公司）作為一抗，生物素化山羊抗兔IgG（生產廠家）作為二抗。對照組用PBS液代替一抗，其他同實驗組。
1.3 結果判定 參考文獻［4］的方法並稍做修改。神經節細胞內出現棕黃色顆粒為免疫組織化學陽性細胞，以染色的深淺及陽性細胞數作為觀察指標，與背景完全一致的記為1，淡黃色記為2，中等黃色記為3，棕黃色記為4。每張切片在10個高倍鏡視野下,分別計數50個細胞，計算陽性細胞的百分比，＜10%記為1， 10%～30%記為2， 30%～50%記為3，>50%記為4。以陽性細胞和染色強度之和的平均數作為定量標準：＜3為陰性表達（-），≥3為陽性表達（+），所有切片結果由病理學專家判定。
1.4 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件包進行分析，所得數據進行四格表資料的χ2檢驗。P≤0.05為差異有顯著性意義。
2 結果
實驗組正常結腸的神經節細胞內可見空腸彎曲菌抗體與神經節細胞結合的棕色顆粒,其陽性率為83.3%；而對照組沒有發現空腸彎曲菌抗體結合的棕色顆粒,其陽性率僅為10%,實驗組與對照組比較差異有統計學意義（χ2＝30.19，P＜0.01，圖1，表1）。
3 討論
腸神經元發育異常是導致小兒頑固性便秘甚至腸梗阻的重要原因，其病因一直是人們爭論的熱點。現在一般認為腸神經元發育異常是由遺傳因素和環境因素（如毒素、炎症、缺血缺氧等）多種原因導致的一種疾病，常常並發結腸炎症［5］。研究發現細菌感染可能是導致此類疾病並發小腸結腸炎的重要原因［6］。而致病細菌的具體種類及與腸神經係統損傷的因果關聯，目前並沒有深入研究。
空腸彎曲菌為革蘭陰性微需氧彎曲菌，被認為是引起全世界人類細菌性腹瀉的主要原因之一,在世界各地和各個年齡組均有日益增長的趨勢。空腸彎曲菌感染的發病率呈雙峰型，以嬰幼兒和15～29歲年齡組最高，在發展中國家多集中在5歲以下（尤其是1歲以內）的兒童，我國最近的調查表明2歲以下小兒腹瀉空腸彎曲菌檢出率最高［3］。對空腸彎曲菌的致病機製的研究認為其致病因素包括黏附、侵襲、產生毒素和分子模擬機製等4個方麵［7］。Schwerer等［8］研究表明空腸彎曲菌感染可以通過分子模擬機製引起外周神經組織的損傷。動物實驗證明，空腸彎曲菌體成分脂多糖核心低聚糖與神經組織成分神經節苷脂有相似的抗原性,當空腸彎曲菌感染機體後, 刺激機體免疫係統產生相應的空腸彎曲菌特異性抗體, 由於存在交叉反應,該抗體不僅與空腸彎曲菌體結合,同時也與神經組織成份神經節苷脂結合,引起局部神經病理損傷［9］。神經節苷脂是維持神經元存活、生長、分化和功能所必需的神經營養物質。在正常發育過程中，神經節苷脂可能參與神經元的生長、分化和表型的表達，以及細胞的遷移和神經生長錐的定向延伸。若神經節苷脂功能失活，會導致細胞黏附分子與細胞膜的結合力下降，從而影響遷移 ,導致神經元的發育異常［10］。神經係統發育成熟以後，神經節苷脂對其具有一定的保護、修複作用。
目前對於空腸彎曲菌導致外周神經係統損傷的研究比較多，主要局限在格林-巴利綜合征上，對於空腸彎曲菌對腸道神經係統有無損傷作用，通過什麽機製導致腸道神經係統損傷，並沒有深入的研究。本研究結果顯示空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經節細胞上的陽性表達率為83.3％，說明空腸彎曲菌抗體可以與腸道正常神經節細胞結合，有導致神經節細胞變性的可能。因而初步認為：在腸道神經係統發育過程中，由於空腸彎曲菌存在的廣泛，並且容易傳播感染，導致患兒感染空腸彎曲菌；由於空腸彎曲菌腸炎在嬰幼兒時期症狀多不明顯，導致大部分患兒病情被忽視，僅部分患兒產生小腸結腸炎表現。空腸彎曲菌感染後，可能通過抗體的分子模擬機製，與神經元的神經節苷脂結合，影響神經元生長、分化、存活，從而阻礙腸道神經節細胞的發育成熟，導致腸道功能障礙的發生。而對於腸道神經係統發育成熟的患兒，空腸彎曲菌可以通過分子模擬機製，破壞對神經元起保護作用的神經節苷脂，使神經節細胞更容易受到毒性產物的損害，導致神經節細胞變性甚至壞死。但是僅通過本研究，並不能充分說明空腸彎曲菌的抗體一定可以導致神經節細胞變性，需要通過進一步的臨床研究，來明確空腸彎曲菌抗體對腸道神經節細胞的作用。
作者：韓克 李金良 李殿國 孫小兵 張麗 宋磊
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