【摘要】 目的 深入研究腸球菌耐藥性的產生機製，指導臨床合理用藥。方法 采用一步誘導法，對8株糞腸球菌、2株屎腸球菌和9株糞腸球菌、1株屎腸球菌進行四環素和左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性；用PCR法檢測四環素耐藥基因tetM、tetL，用PCR法擴增gyrA、parC基因後測定DNA序列。結果 10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的四環素耐藥株。耐藥株的MIC分別為16～128μg/ml，與原株（MIC0.25μg/ml、2μg/ml）比較，增加了16～512倍。在1株實驗菌的誘導耐藥株的質粒DNA上檢測到tetL耐藥基因，另一株實驗菌株的誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM耐藥基因；10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的左氧氟沙星耐藥株。誘導耐藥株的MIC分別為16～64μg/ml，與原株（MIC 2μg/ml、2μg/ml）比較，增加了8～32倍。GyrA的QRDR內的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR內的第80位的氨基酸均發生了改變。結論 一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗的結果表明，腸球菌可在高於耐藥MIC濃度的抗菌藥物短期作用後獲得耐藥性。
【關鍵詞】 腸球菌 抗菌藥物 誘導性耐藥 抗菌藥物壓力
近年來，腸球菌作為一種引起醫院感染的重要病原菌已經引起了醫學界的廣泛關注。美國醫院感染監視係統(NISS)已將其列為引起醫院感染的第二大病原菌［1］。
腸球菌不僅具有天然耐藥性，而且更易被誘導產生新的耐藥性。Tankovic報告對環丙沙星耐藥的腸球菌由1987～1989年期間的不到2%增加到1991～1993年間的14%以上，而且是由該類藥物在臨床上的應用增加所致［2］。在瑞典Huddinge醫院，對喹諾酮耐藥的腸球菌由1994年的11%增加到1997年的25%［3］。而國內1997～2001年期間臨床分離的腸球菌對環丙沙星耐藥率分別為糞腸球菌44.2%，屎腸球菌70.7%［4］。在美國，由於萬古黴素的使用，1989～1993年間腸球菌對萬古黴素的耐藥率增加了20倍。這些統計學臨床資料已經顯示，抗菌藥物的臨床應用造成的藥物選擇性壓力可能是引起腸球菌耐藥性的產生與擴散的重要原因之一。
為深入探索腸球菌耐藥性的產生和發展，本課題就此進行了部分抗菌藥物的實驗研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 實驗菌株TE1～TE10（TE3、TE9為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用於四環素誘導性耐藥試驗。實驗菌株LE1～LE10（LE2為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用於左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。質控菌株為糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299。
1.1.2 抗菌藥物 左氧氟沙星（LEV，5μg/片）、四環素(TCY，30μg/片)藥敏紙片購自Oxoid公司。四環素、左氧氟沙星粉劑購自中國生物製品研究所。
1.1.3 試劑 心腦浸液、M-H瓊脂，購自BECTON-DICKINSON公司。Vitek細菌鑒定卡及藥敏鑒定卡購自法國生物梅裏埃公司。PCR引物由賽百盛公司合成。四環素耐藥基因tetM引物為5′-GAC ACG CCA GGA CAT ATG G-3′， 5′-TGC TTT CCT CTT GTT CGA G-3′；四環素耐藥基因tetL引物為5′-ATA AAT TGT TTC GGG TCG TTA AT-3′，5′-AAC CAG CCA ACT AAT GAC AAT GAT-3′；DNA消旋酶gyrA引物為5′-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3′，5′-AAT TTTACT CAT ACG TGC TTC GG-3′；DNA消旋酶parC引物為5′-AAA CCT GTT CAG CGC CGC AT-3′，5′-TCG GTG TAA CGC ATT GCC GC-3′。
1.1.4 儀器設備 Vitek AMS-60全自動細菌鑒定及藥敏係統（法國生物梅裏埃公司）。AG-9600 AMPLISENSOR MINILYZER PCR擴增儀（美國）。
1.2 方法
1.2.1 實驗菌株的選擇 依據細菌鑒定及MIC結果，最終選擇對四環素敏感的8株糞腸球菌和2株屎腸球菌（MIC 0.25～4μg/ml）作為四環素誘導性耐藥的實驗菌株；對左氧氟沙星敏感的9株糞腸球菌和1株屎腸球菌（MIC 0.5～2μg/ml）作為左氧氟沙星誘導性耐藥實驗菌株。
1.2.2 藥物敏感性試驗 瓊脂稀釋法參照2002年NCCLS推薦的方法進行操作及判讀結果，同時測定糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299的MIC進行質控。
1.2.3 四環素誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照文獻［5］及腸球菌對四環素耐藥的MIC界值，首先確定四環素誘導耐藥試驗的藥物濃度為20μg/ml、細菌接種量為107CFU/每個平板。將實驗菌製備成1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液加入到含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板上，用無菌L形棒均勻塗布平板，35℃培養24h、48h、72h、96h、120h後觀察結果，並記錄生長的菌落數。取培養後生長出的菌落，純培養後製備1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液塗布接種新鮮製備的含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板，35℃培養18～24h，觀察有無細菌生長。在新鮮製備的及35℃分別放置了24、48、72、96和120h的含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板上，塗布接種100μl 1×108CFU/ml糞腸球菌ATCC29212及實驗菌懸液，於35℃培養18～24h後觀察有無菌落生長。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性，用PCR檢測tetL和tetM耐藥基因。
1.2.4 左氧氟沙星誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照四環素誘導性耐藥試驗，首先確定左氧氟沙星誘導耐藥試驗的藥物濃度為10μg/ml。其餘步驟基本同四環素誘導性耐藥試驗。此外，對部分誘導出的菌株的gyrA和parC基因擴增後，進行DNA序列分析。
1.2.5 誘導性耐藥菌株的穩定性試驗 將誘導的耐藥菌接種在無抗菌藥物BHI肉湯中，35℃培養，每24h轉種一次，連續培養10代。然後進行藥物敏感性測定。
1.2.6 耐藥基因測定 堿裂解法製備質粒DNA、參照方法［6］製備染色體DNA。PCR反應體係100μl，含模板DNA約0.2μg，引物0.2μmol/L，0.2mmol/L dNTP，10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，2.5U TaqDNA聚合酶。耐藥基因DNA測序：將gyrA、parC和部分實驗菌株的tetL基因擴增產物經DNA純化後送北京華大中生科技發展有限公司測序部進行DNA序列測定。測序結果對照基因庫檢索結果進行分析。
2 結果
2.1 四環素誘導性耐藥試驗結果
2.1.1 誘導性耐藥培養結果 (1)實驗菌TE5和TE8在48h～120h培養過程中分別生長了131、87個菌落。TE1～TE4、TE6～TE7、TE9～TE10實驗菌株在120h培養過程中，無菌落生長。(2)將48～120h生長的菌落再次以相同的菌量分別接種含四環素BHI瓊脂平板，24h培養後菌落融合生長成菌膜。(3)在35℃已經放置了24～120h的含四環素BHI瓊脂平板上，分別接種了TE5、TE8和ATCC29212，24h培養後無肉眼可見的菌落生長。
2.1.2 誘導性耐藥菌株的藥物敏感性 隨機選擇的48h和72h生長出的誘導菌株全部為四環素單耐藥株，與原株相比，TE5、TE8誘導株的MIC分別增加了64～512和16～64倍。藥敏結果詳見表1。將誘導的耐藥菌株在BHI肉湯中進行連續10天的傳代培養後測定MIC，結果與傳代前比較無明顯改變。
表1 四環素誘導的菌株的耐藥性
注：TE521、TE522、TE821、TE822分別為實驗菌株TE5和TE8的48h誘導耐藥株；TE531、TE831、TE532、TE832分別為實驗菌株TE5和TE8的72h誘導耐藥株。
2.1.3 誘導性耐藥菌株耐藥基因的檢測 對原株、耐藥菌株TE521，TE821；TE531，TE831；TE532，TE832，經PCR擴增檢測四環素耐藥決定子tetL、tetM。結果在 TE5及誘導耐藥株的質粒DNA上檢測到tetL，在TE8誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM。對TE5、TE521的tetL基因進行了測序，其結果與Genbank中的序列同源性為99%，TE5與TE521的序列完全一致。
2.2 左氧氟沙星誘導耐藥性試驗結果
2.2.1 誘導性耐藥培養結果 (1)實驗菌株LE1，LE5在48h～120 h培養過程中分別生長了54、48個菌落。LE2～LE4、LE6～LE10實驗菌株在120h培養過程中，無菌落生長。(2)48～120h生長的菌落再次以相同的菌量接種含左氧氟沙星BHI瓊脂平板，24h培養後生長成菌膜。(3)在35℃已經放置了24～120h的含左氧氟沙星BHI瓊脂平板上，分別接種了1×107CFU/平板的LE1、LE5和ATCC29212，在24h培養後無肉眼可見的菌落生長。
2.2.2 誘導性耐藥菌株的耐藥性 誘導獲得的耐藥菌株全部為左氧氟沙星單耐藥菌株，與原株相比，LE1、LE5誘導耐藥株的MIC分別增加了16～32倍和16倍。將誘導的耐藥菌株在BHI肉湯中進行連續10天的傳代培養後測定MIC，結果與傳代前比較無明顯改變。結果詳見表2。
表2 左氧氟沙星誘導的菌株的耐藥性
注：LE121、LE131、LE141分別為實驗菌株LE1在48h、72h和96h誘導培養後生長的菌株；LE521、LE531、LE541分別為實驗菌株LE5在48h、72h和96h誘導培養後生長的菌株。
2.2.3 誘導性耐藥菌株的耐藥基因檢測 對原株、耐藥菌株LE121，LE521；LE131，LE531；LE141，LE541和標準菌株ATCC51299、ATCC29212，分別經PCR擴增gyrA和garC。結果全部菌株均在擴增產物的電泳圖譜上出現了241bp的gyrA和248bp的parC條帶。gyrA經測定DNA序列，LE121的喹諾酮耐藥決定區（QRDR）內的第87位的穀氨酸(密碼子GAA)置換為賴氨酸(密碼子AAA)。LE131 QRDR內的第83位的絲氨酸(密碼子AGT)置換為異亮氨酸(密碼子ATT)。LE141 QRDR內的第83位的絲氨酸(密碼子AGT) 置換為精氨酸(密碼子AGA)。LE521、LE531、LE541 QRDR內的第87位的穀氨酸(密碼子GAA)均置換為賴氨酸(密碼子AAA)。parC經測定DNA序列，LE1和LE5的誘導耐藥株與原株比較，parC 編碼的蛋白質QRDR內的第80位的絲氨酸(密碼子AGT)均置換為異亮氨酸（密碼子ATT）。結果詳見表3、表4。
表3 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的gyrA序列改變
表4 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的parC序列改變
3 討論
在一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗中，分別接種了1×107CFU實驗菌於含高於耐藥MIC濃度的左氧氟沙星BHI瓊脂平板和四環素BHI瓊脂平板上，實驗菌株在24h培養後均無肉眼可見的菌落生長，表明腸球菌對左氧氟沙星和四環素耐藥菌株的自發突變率一般低於1×10-7。48h後誘導生長的菌株再次接種含抗菌藥物BHI瓊脂平板，則於24h培養後生長成菌膜，表明為非緩慢生長的腸球菌。實驗菌株和ATCC29212接種在35℃已預先放置了24～120h的含抗菌藥物BHI瓊脂平板上，培養24h後無菌落生長，示誘導生長的菌株不是因為培養基中的抗菌藥物活性下降所致。藥物敏感性測定結果表明誘導後生長的菌株均單獨對左氧氟沙星或四環素耐藥。以上結果表明分別在含左氧氟沙星或四環素的BHI瓊脂平板上，於48h後生長的菌株均應為藥物誘導產生的耐藥菌株。
腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機製是由於DNA促旋酶A亞單位（gyrA）和拓撲異構酶Ⅳ（parC）基因突變引起。一般認為parC為腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的第一突變基因，低中水平耐藥一般僅有parC突變，高水平耐藥常既有parC突變，又有gyrA的突變，尚未發現僅有gyrA突變而無parC突變的腸球菌耐藥菌株。本實驗中誘導的耐藥株未見gyrA編碼的蛋白質QRDR內的第83和87位氨基酸，或parC 編碼的蛋白質QRDR內的第80和84位氨基酸同時發生改變的誘導耐藥株。此結果與文獻報道類似［7］。
腸球菌對四環素的主要耐藥機製為產生外排蛋白和核糖體保護因子，其中最主要、最常見的2種耐藥決定子為tetL、tetM。本實驗誘導的四環素耐藥株的PCR擴增結果顯示，TE8實驗株的誘導耐藥株全部含有tetM耐藥決定子，而未檢測到tetL耐藥確定子。TE5實驗株及其誘導耐藥株全部檢測到tetL，而未檢測到tetM。TE5實驗株為四環素敏感菌株，其MIC為0.25μg/ml，但在其質粒中檢測到tetL耐藥決定子，此種基因型和耐藥表型不一致的現象尚未見報道。推測可能為某種因素抑製了tetL的表達，經四環素作用後，解除了對tetL表達的抑製，進而對四環素產生耐藥。
本研究中對誘導的耐藥菌株耐藥基因的檢測結果表明，實驗誘導的耐藥菌株的基因型與臨床分離的腸球菌基本一致，這不僅從分子水平進一步證明了本研究中抗菌藥物作用下生長的菌落為耐藥菌株，而且從某種程度上顯示臨床耐藥菌株的產生和擴散與抗菌藥物的使用確實密切相關。
已有的大量文獻表明臨床上廣泛應用和濫用抗菌藥物是引起細菌耐藥性產生和發展的主要原因之一。本研究通過體外實驗證實了腸球菌可在高濃度的抗菌藥物作用後獲得耐藥性。因此在臨床抗感染治療中應該合理使用抗菌藥物。
作者：劉貴建 許淑珍《中華實用醫藥雜誌》
【參考文獻】
1 Schaberg DR，Culver DH，Gaynes RP．Major trends in the microbial etiology of nosocomial infections.Am J Med，1991，91:72-75.
2 Tankovic J，Mahjoubi F，Courvalin P，et al．Development of fluoroquinolone resistance in enterococcus faecalis and role of
mutations in the DNA gyrAse gyrA gene．Antimicrob Agents Chemother，1996，40：2558-2561.
3 Amin EL，Jalal S，Wretlind B．Alterations in gyrA and parC associated with fluoroquinolones resistance in enterococcus faecium．Antimicrob Agents Chemother，1999，43：947-949.
4 劉貴建，許淑珍，李景雲，等.北京地區和其他地區臨床分離的腸球菌耐藥性比較分析.中華醫學雜誌，2003，83:1049-1052.
5 Alonso A，Campanario E，Martinez JL．Emergence of mutidrug-resistent mutants is increased under antibiotic selective pressure in Pseudomonas aeruginosa．J Microbiol，1999，145：2857-2862.
6 林萬明.PCR技術操作和應用指南，北京：人民軍醫出版社，1995，31-32.
7 Kanematsu E，Deguchi T，Yasuda M，et al．Alterations in the gyrA subunit of DNA gyrAse and the parC subunit of DNA topoisomerase
Ⅳ in enterococcus faecalis．Antimicrob Agents Chemother，1998，42:433-435.
