大腸杆菌變種的分子生物學檢測方法研究進展

大腸杆菌是最常見的微生物之一，在自然界廣泛分布，在動物體內也存在。它具有易培養、生長快、易變異等特點。腸出血性大腸杆菌(enterohemorrhagic E. coli，EHEC)是大腸杆菌的一個變種，曾在多個國家暴發流行。目前美國、加拿大等國家也出現了新的耐藥性變種［1］，導致了多人死亡。因此大腸杆菌致病變種引起了國內外學者的密切關注，並對大腸杆菌變種進行了深入的研究。筆者以EHEC血清型O157：H7為例，對它的分子生物學檢測方法進行綜述，為對該菌引起的疾病進行預防、診斷和治療提供參考依據。

    大腸杆菌 O157：H7 曾多次在世界各地，特別是發達國家引起廣泛的暴發流行。感染主要導致腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，並經常伴發溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓形成的血小板減少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP) 並發症，嚴重威脅著人類的生命健康［2］。人類感染此菌的途徑主要是食用或接觸汙染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。
   
　　EHEC菌株能產生毒素，編碼這些毒素的基因包括誌賀菌素1基因(st x1)、誌賀菌素2基因(st x2)、大腸杆菌粘附與消除基因(eae)和腸溶血素基因(ehx)等。大腸杆菌O157:H7是與人類疾病相關的最常見血清型細菌。1982年，美國學者首次從出血性腹瀉患者的糞便標本中分離到該菌，並報道與食用漢堡牛肉餅有關。這是人類第一次認識到大腸杆菌O157:H7可作為一種病原菌使人類致病，但當時並沒有引起醫學界的足夠重視。此後，大腸杆菌O157:H7引起的感染在美國、加拿大、英國和日本等發達國家迅速增加,逐漸引起廣泛重視。我國於1987年由權太叔等首次從出血性結腸炎患者糞便中分離到O157:H7大腸杆菌。此後，福建、浙江、廣東、河北、寧夏等十幾個省陸續分離出該菌。為防止類似事件出現，1997年5月建立了全國O157:H7大腸杆菌檢測網絡。
   
　　大腸杆菌O157:H7對人的致病力較強，每克感染載體含菌10個以上即可能引起感染。因此，在流行病學調查中，特異、靈敏及快速檢測O157:H7的方法顯得尤為重要。隨著分子生物學技術的迅速發展，使得快速、準確檢測O157:H7成為可能，並為該領域的研究開拓了更廣闊的前景。

　　2.1 聚合酶鏈反應(PCR)技術 

　　該技術是最常用的檢測大腸杆菌O157:H7致病基因的方法。目前已從單一PCR發展到多重PCR乃至實時熒光定量PCR（RQ- PCR ）。Paton 等［3］采用多重PCR 方法擴增st x1 、st x2、eae、ehxA和saa基因，發現所檢測的ETEC(大腸杆菌O157:H7是其中一種)中，有幾種或全部為致病基因。Fey 等［4］ 對335份腹瀉患者的糞便樣品進行選擇性細菌培養，再從中選擇可疑菌落進行檢測。用多重PCR的方法檢測到14株ETEC，與聯合應用傳統的細菌分離培養和酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)相比，分離的菌株數相同。從而證明，PCR是一種與細菌常規分離培養和EIA聯合應用、具有相同敏感性和特異性的方法。由於其速度快，可作為一種診斷由EHEC感染引起腹瀉的替代方法。

    近年來，隨著RQ-PCR的發展，這種技術也被用於大腸杆菌O157:H7的檢測。RQ-PCR是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。常規PCR技術隻能對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，也無法對擴增反應進行實時檢測。RQ-PCR通過對引物、探針或擴增產物進行熒光標記使對積累的擴增產物進行實時檢測成為可能。Ct值即PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數，模板DNA量越多，熒光達閾值的循環數越少，即Ct值越小。朱海等［5］使用RQ-PCR檢測生果、蔬菜中大腸杆菌O157∶H7，說明熒光定量PCR檢測方法比傳統分離培養法靈敏度更高。Bellin等［6］在45min內用這種方法檢測了32個EHEC菌株中的st x1和st x2基因，證明實時定量PCR是一種快速檢測EHEC的方法。同時，該試驗對重複結果為陰性的試驗也較為迅速。

    因此，這種方法在處理大量懷疑含大腸杆菌O157:H7樣品時可使用，如在臨床微生物中糞便分析或食品安全性檢驗中的應用。

    運用PCR方法檢測與疾病相關的毒素基因還有助於對疾病發病機理的了解。有研究表明［6］，從ETEC感染患者體內分離的EHEC中，大部分含有與毒力相關的90kb質粒編碼的ehxA基因。從引起出血性腸炎和HUS患者體內分離的EHEC中含有st x2和eae基因，而從無症狀攜帶者分離的EHEC缺少eae基因，說明缺少eae基因也就使ETEC缺乏了腸上皮細胞的粘附機理。

　　2.2  限製性片段長度多態性(RFLP) 

　　RFLP是根據不同樣品(個體)基因組或某個基因的限製性內切酶的酶切位點之間發生了堿基的替換、重排、插入、缺失等，導致產生新的限製性酶切位點或丟失某些酶切位點。新切點的出現可使限製性片斷的長度縮短，而舊切點的丟失可使限製性片斷的長度增大。通過基因的PCR擴增、限製性內切酶酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色後，在紫外光下直接觀察，可比較不同樣品(個體)DNA水平的差異(即多態性)。RFLP是目前細菌亞分類最常用的方法之一，該法也被成功用於大腸杆菌O157:H7的多態性分析。Zhang等［7］用PCR-RFLP對從人分離的大腸杆菌st x1基因的變化情況進行了分析，從有腹瀉症狀的患者分離的大腸杆菌中檢測到st xB1，無症狀攜帶者分離的大腸杆菌中檢測到st xB1的等位基因(命名為st xB1c ) 。用限製性內切酶FspⅠ酶切282bp 的st xB1及st xB1c、st xB1 酶切的結果得到189bp和93bp兩個片段；st xB1c沒有被切開，用限製性內切酶HhaⅠ進行酶切，st xB1得到135bp、92bp和55bp 3個片段；st xB1c得到218bp和64bp兩個片段。選擇包括EDL933 的共6個菌株(均有st x1)作對照試驗，酶切的結果與st xB1一致。從上述結果可見，隻運用PCR技術無法解釋相同病原菌編碼相同基因引起感染卻出現不同症狀的情況，RFLP 方法為大腸杆菌O157致病機理的研究提供了一條更加有效的途徑。

　　2.3  隨機擴增多態性DNA(RAPD) 

　　RAPD建立在PCR基礎上，使用一係列具有10個堿基的單鏈隨機引物，對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測其多態性。分析時所用引物數很大，雖對每一個引物而言，其檢測基因組的DNA多態性區域有限，但利用一係列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此，RAPD可以對整個基因組DNA 進行多態性檢測。目前該項技術也被用於大腸杆菌O157:H7的多態性檢測。Radu等［8］對從15份牛肉和3份雞肉樣品中分離出的28株O157:H7分別進行RAPD和PFGE分析，並繪製了進化樹。RAPD將其分為兩個組群，22個亞組群，PFGE將其分為兩個組群，28個亞組群。Johnson等［9］對日本京都一家工廠暴發的大腸杆菌O157：H7感染調查中，也分別用RAPD和PFGE對從患者糞便中分離的O157：H7進行了多態性分析，並與在東京暴發流行該病時分離的菌株進行比較，發現兩者的結果沒有差異。在以PCR技術為基礎檢測DNA多態型的眾多方法中，RAPD是一種快速、簡單的方法。它為大腸杆菌O157：H7提供了一種高效區分不同亞組群的方法。雖然相對於PFGE其區分能力略遜一籌，但它快速簡單，不像PFGE需要較長時間，可作為PFGE方法的參照。另外，RAPD對DNA的要求不高，隻需少量模板就可用於擴增反應，適用於從食物樣品和糞便中分離的多個菌株的分析。

　　2.4  隨機片段長度多態性(AFLP) 

　　AFLP技術由Zobeau 等於1992 年創立。該方法結合了RFL P 和RAPD 技術的特點，利用兩種或兩種以上的酶切割DNA ，形成不同酶切位點的限製性酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR 擴增的模板。對於PCR的引物，AFLP作了修飾,將引物與酶切片段識別序列結合起來，其引物從5′→3′依次為核心序列、酶切識別序列、3′端選擇堿基序列。而核心序列與人工接頭互補，從而實現選擇性擴增。DNA 片段經兩種或兩種以上的酶同時切割，如果遺傳特性發生改變，則酶切片段數目、長短發生變化，從而實現多態性。Iyoda等［10］分析了46株大腸杆菌O157:H7和其他血清型大腸杆菌O26：11、O114：19、O119：N，結果顯示，同一地區暴發分離的大腸杆菌O157：H7菌株的AFLP條帶結果具有同一性，在亞分類時可將其歸入同一組群。該結果與脈衝凝膠電泳得出的結果一致。Zhao等［11］利用該方法對48株O157:H7進行了分析，並在每對引物的一條引物帶上標記熒光素，以便進行儀器解讀，稱為熒光AFLP(FAFLP)，共獲得37種不同基因組的DNA指紋，PFGE獲得21種，說明FAFLP在一定條件下可以提供更詳細的PFGE不能區分的DNA樣品指紋圖。

　　Smith等［12］通過對71株O157進行FAFLP分析表明，FAFLP較目前的分子生物學分類方法在理論上更為先進，實際操作中更易於標準化。與PFGE方法相比，它可得到的大量更為詳盡的數據，擴增片段可精確到±1bp。在相同的消化連接反應中，通過使用不同的選擇性引物，可提高或降低其鑒別能力。

    AFLP技術與RAPD技術一樣,能產生豐富的多態性，但RAPD技術是在高Mg2+濃度、低複性溫度、短引物序列(10bp)允許引物與模板錯配等不嚴格條件下進行擴增，結果易受外界因素的影響，重複性較差［12］。AFLP技術則不同，引物與模板嚴格配對的堿基數多達17個，且在56℃退火溫度下進行，其結果的可靠性高於RAPD。而RFLP等技術需要預先製備相應的DNA探針並進行雜交，才能得到較低多態性的結果［13］。AFLP技術克服了上述兩種方法的缺點，即能獲得較好的多態性,並且實驗結果穩定、可靠、重複性好、分辨率高［14］。但AFLP技術也存在一些不足,如成本高、酶切條件及引物需要篩選、所需時間略長。

　2.5  脈衝場凝膠電泳(PFGE) 

　　PFGE的基本原理是通過電場的不斷改變，使包埋在瓊脂糖凝膠中的DNA分子的泳動方向做相應改變，小的DNA分子比大的變化快，故小分子泳動得快，從而在凝膠上按染色體大小而呈現出電泳帶型。DNA帶的密度在一定程度上反映了細菌內DNA的含量以及DNA分子的大小，最終達到分型的目的。

    PFGE常用於基因組DNA的分析，是目前分子流行病學調查最經典的方法［15］，已成功用於眾多微生物的遺傳性分析［16］，被世界上許多實驗室作為菌株基因分型的參考方法，是迄今最常用的亞分類方法。目前對病原細菌常用的分子生物學分型方法有：RFL P，特定片段PCR，RAPD，基因外重複回文序列PCR(Rep-PCR)，裂解酶片段長度多態性(CFLP)，擴增片段長度多態性(AFLP),Multiple-locus variable-number tandem repeats analysis,MLVA)以及Multiple-locus sequence typing,MLST)多位點序列分析等。PFGE與以上方法相比，具有重複性好、分辨率高［17］、結果穩定、易於標準化的優點，能在細菌基因組很龐大的情況下，盡可能反映較多的變異信息。但是也存在一定的缺點［18］，比如耗時；電泳帶型易受人為等多種因素的影響；並不是對所有情況都適合；不能同時優化膠的每個部分的條帶分布；不能確切地認為相同大小的條帶就是相同的DNA片段；不同條帶之間並不是無關的、相互獨立的，而是互相聯係的；一個酶切位點的變化可能引起不止一個條帶的變化；結果不易分析，沒有國際統一標準，不易於在實驗室之間進行比較，且儀器價格昂貴。

    PFGE適用於檢測較罕見的限製性內切酶產生數量較少，而片段較大的DNA片段，這些片段因分子量較大，常規電泳不能將其分開，但可用一個不斷變化的(脈衝)電場將其分開。美國國家公共衛生實驗室已完成了PFGE標準化流程的製定，並在多次不同的O157:H7暴發流行中應用。Xu等［19］從113隻金龜子中分離到4株大腸杆菌O157:H7，從383份腹瀉患者糞便中分離到10株大腸杆菌O157:H7。對分離到的14株O157:H7進行基因組DNA PEGF分析，其中4株從金龜子分離的O157:H7與9株從腹瀉患者分離的O157:H7 PEGF的結果一致，從而證明14株O157:H7具有相同的起源。金龜子可能通過接觸糞便而攜帶大腸杆菌O157:H7，並在糞便運輸過程中傳播該菌。Kruger等［20］對分別來自牛(59株)、羊(4株)和腹瀉患者(33株)的大腸杆菌O157進行RAPD-PCR和PFGE分型。RAPD-PCR結果顯示，總共96株菌隻是在條帶的亮度上有所差異，具有高度的單形性；PFGE結果則可將96個菌株分為76個不同的基因組形式，證明了PFGE在基因分型中的優勢。Radu等［7］從食品中分離大腸杆菌O157進行的基因分型試驗也證明了PFGE的優越性。PFGE已被證明，在大腸杆菌O157:H7的分子流行病學調查中是一種可靠的分型方法。

　　2.6  多位點可變數銜接重複序列分析(MLVA)
 
　　MLVA多用於哺乳動物親緣關係的分析，近年來也被用來作細菌多態性檢測，已有多種細菌采用該方法進行分型，如炭疽杆菌［21］、耶爾森菌［22］、結核分支杆菌［23］。在真核生物基因組中存在大量的數目可變的銜接重複序列(variable number tandem repeat，VNTR)。VNTR是由幾個核苷酸(最常見為2～4個)作為核心序列串聯重複形成的DNA序列，在原核生物基因組中也發現了這種序列，但它的一般長度不到原核生物基因組的1/10。這種序列可存在於原核生物基因中，也可存在於基因之間。大腸杆菌O157：H7中發現，有7個VNTR，重複數從6～30個堿基不等，其中6個存在於染色體DNA上，另一個存在於編碼毒力基因的質粒上。通過不同菌株基因組核心序列串聯重複數的差異，可檢測大腸杆菌O157：H7的多態性。Lindstedt等［24］用MLVA方法，將69株大腸杆菌O157分為45個不同型別，用PFGE方法將它們分為44個，證明ML2VA與PFGE相比具有相同的靈敏度和更高的特異性，具有很多優點。首先，它無需抽提基因組DNA；其二，該法重複性好，即使不同實驗者也可得到相同的條帶形式；第三，可製定統一標準，易於各實驗室間進行比較；第四，能在較短時間內處理大量樣品。運用分子生物學分型方法檢測大腸杆菌O157：H7的多態性，為調查其是否潛在暴發流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工業中O157：H7的汙染檢測也更為方便，關鍵控製點易於找到，使得有適當措施被貫徹來保證食品的安全。

綜上所述，大腸杆菌O157：H7有多種分子生物學檢測方法。不同的方法各有優缺點，我們應該根據檢測目的和實驗室擁有的條件選擇最適合的方法進行檢測以及其他研究。

作者：黃衍強  右江民族醫學院微生物學教研室

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