兩種酵母菌藥敏試驗的介紹及比較

【摘要】  目的：建立一種簡便、實用的酵母菌藥敏試驗方法。方法：酵母菌紙片擴散法。結果：38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上對氟康唑的平均抑菌圈直徑分別為31.32 mm和31.26 mm，t=0.16，P=0.874>0.05；38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上對沃爾康唑的平均抑菌圈直徑分別為33.50 mm和33.24 mm，t=1.15，P=0.257>0.05。結論：M44P酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案操作簡便、實驗結果穩定、可靠。

【關鍵詞】  酵母菌藥敏試驗方法 酵母菌紙片擴散法 比較

    隨著各種抗真菌藥物的相繼問世和耐藥真菌菌株的出現，真菌藥物敏感性試驗已越來越受到人們的重視，為此美國臨床試驗室標準化委員會（NCCLS）於2003年介紹了M44P酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案，製定了氟康唑（floconazole）和沃爾康唑（voriconazole）質控株的參考範圍及氟康唑的抑菌圈解釋標準，研究已證實氟康唑對酵母菌的紙片擴散法敏感試驗有很好的重複性，可方便、準確地檢測酵母菌對氟康唑的敏感性［1～5］。我科同時用M44P方案和M27A方案酵母菌紙片擴散法敏感試驗兩種方法對36株臨床常見酵母菌及2株質控株進行氟康唑和沃爾康唑紙片擴散法敏感試驗進行比較。

　　1.1  試驗菌株 

　　36株臨床常見酵母菌來源於臨床各科送檢的痰液、尿液及陰道拭子等標本，用SDA（沙保弱培養基）分離培養，先經科瑪嘉顯色培養基初步鑒定，後經API 20C準確鑒定，其中有白色假絲酵母菌19株，熱帶假絲酵母菌5株，光滑假絲酵母菌4株，克柔假絲酵母菌3株，近平滑假絲酵母菌3株，季也蒙假絲酵母菌2株；質控菌株：白色假絲酵母菌ATCC90028 1株和近平滑假絲酵母菌ATCC22019 1株均為北京協和醫院細菌室老師惠贈。

　　1.2  設備 

　　(35±1)℃孵育箱，0.5號麥氏標準比濁管（自配方法：取0.5 ml 0.048 mol/L BaCl2(1.175%W/VBaCl2·2H2O)加入99.5 ml 0.18 mol/ H2SO4溶液中即可獲得0.5號麥氏標準比濁管。

　　1.3  藥敏紙片 

　　氟康唑25 μg/片，沃爾康唑1 μg/片。

　　1.4  M44P方案酵母菌藥敏培養基 

　　此培養基是在普通細菌藥敏試驗所用的MH瓊脂基礎上，經補充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美藍改良而成。具體製法：500 ml MH瓊脂中加入50 ul美藍（Methylene blue）貯存液（0.1 g美藍加入20 ml無菌蒸餾水即為美藍貯存液）和10 g葡萄糖，調節pH至7.0，121℃，15 min高壓滅菌，出鍋後在56℃水浴數分鍾，在直徑為90 mm的平皿中倒入25 ml，使培養基厚度約為4 mm。

　　1.5  M27A方案酵母菌藥敏培養基 

　　RPMI1640+2%葡萄糖+MOPS+2%Bacto瓊脂。具體製法：將Bacto瓊脂20 g、MOPS 40 g、葡萄糖20 g溶於900 ml蒸餾水中，調節pH至7.0，115℃高壓15 min，出鍋後冷卻到45℃時加入RPMI1640一袋，混勻即可傾注平皿，在直徑為90 mm的平皿中倒入25 ml，使培養基厚度約為4 mm。

　　1.6  方法

　　1.6.1  製備濁度為0.5麥氏管濁度的酵母菌懸液 

　　用接種環挑取數個酵母菌菌落到2 ml的無菌生理鹽水中使酵母菌懸液的濁度為0.5麥氏管濁度，使酵母菌的菌量約為（1～5）106個/ml。

　　1.6.2  接種藥敏平皿 

用上述製備好的酵母菌懸液浸濕無菌棉簽後，讓棉簽在試管壁上輕輕擠壓，擠掉多餘的酵母菌懸液，用棉簽的側麵而不是頂端從三個不同角度密塗平皿，每個角度相差約60°，最後沿平皿內緣塗沫一周，每株酵母菌接種M44P和M27A方案酵母菌藥敏培養基各一塊，在塗布細菌的過程中應避免劃破平皿上的瓊脂，以免影響觀察實驗結果。

1.6.3  貼藥敏紙片 

　　把接種好酵母菌懸液的藥敏平皿放入35℃的孵箱放置約10 min（目的是讓瓊脂充分吸收酵母菌懸液，避免此液體稀釋紙片上的藥物，導致紙片上藥物的擴散速度與酵母菌的生長速度的不協調性），取出後，在每塊平皿上貼氟康唑（floconazole）（25 μg/片）和沃爾康唑（voriconazole）（1 μg/片）各一片，使紙片距離平皿邊緣在15 mm以上，兩紙片間距在30 mm以上，輕輕壓實，切勿讓藥敏紙片脫落。

　　1.6.4  孵育 

　　讓平皿底朝上蓋朝下，35℃孵育18 h～24 h後判讀藥敏試驗結果，如果真24 h生長不足，就延長到48 h再判讀試驗結果。

　　1.6.5  判讀結果 

　　以80%抑製區判讀為測量邊界，在抑菌圈邊緣或內部<20%的少量菌落可忽略不計，測量抑菌圈直徑要準確到毫米；NCCLS規定的氟康唑和沃爾康唑對標準菌株抑菌圈直徑（mm）的質控允許範圍見表1，NCCLS規定的氟康唑紙片擴散法解釋標準和相應的最小抑菌濃度見表2，但是需要特別指出的是:到目前為止，NCCLS還沒有建立沃爾康唑紙片法的解釋標準。表1  氟康唑和沃爾康唑對不同標準菌株24 h抑菌圈直徑（略）表2  氟康唑紙片擴散法解釋標準和相應的最小抑菌濃度（略）

　　1.7  質量控製 

　　試驗時，以白色假絲酵母菌ATCC90028和近平滑假絲酵母菌ATCC22019為對照同時進行，其24 h抑菌圈直徑（mm）在規定的允許範圍之內。

　　1.8  數據分析 

　　采用John Steeling創建的WHO NET5和SPSS 11.5處理。

    我科的檢測結果見表3。表3  我科檢測的2株質控酵母菌及36株臨床酵母菌在兩種平皿上的結果(略)

    2株標準質控菌株在M44P方案和M27A方案的兩種平皿上對氟康唑和沃爾康唑24 h抑菌圈直徑（mm）在質控允許的範圍之內。38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上對氟康唑的平均抑菌圈直徑（mm）分別為31.32 mm和31.26 mm，經配對t檢驗，t=0.16，P=0.874>0.05,說明氟康唑在M44P方案平皿和M27A方案平皿上的藥敏試驗結果無明顯差異；38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上對沃爾康唑的平均抑菌圈直徑（mm）分別為33.50 mm和33.24 mm，經配對t檢驗，t=1.15，P=0.257>0.05,說明沃爾康唑在M44P方案平皿和M27A方案平皿上的藥敏試驗結果無明顯差異。

    近年來，真菌病發病率呈明顯上升趨勢，特別是條件致病性真菌感染更為常見，這與臨床上濫用抗生素、經常應用激素及免疫抑製劑、抗癌藥物導致機體免疫功能下降有關，加之真菌對抗真菌藥物耐藥性日益加重，因而加強對臨床分離出的酵母菌進行藥敏試驗已迫在眉睫。目前，真菌藥敏試驗方法不多，主要有NCCLS推薦的M44P方案、M27A方案和Etest法，三種方法均有很好的穩定性，我科經過實際對比發現M44P方案和M27A方案有很好的一致性；但是M27A方案材料不易獲得，而Etest法價格昂貴，唯獨M44P方案是在普通細菌藥敏試驗所用的MH瓊脂基礎上，經補充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美藍改良而成，此法材料易得，價格便宜，操作簡便，每個細菌室均可開展此項工作，且檢測結果穩定、可靠，是值得基層臨床微生物實驗室進一步推廣的一種較好的方法。

 作者：楊斌 李華 

【參考文獻】
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　　［5］徐英春，謝秀麗.M44P酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案的介紹［J］.中華醫學雜誌,2003,4：6668.