氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

【摘要】  目的 分離得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法 采用選擇性培養基從農藥廠的汙泥中進行富集和分離篩選高效菌株，並且用16S rDNA序列分析法和其生理生化特征對其進行鑒定。結果 該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)，命名為Klebsiella sp.J2（登錄號為AY989899），菌株J2能以氯氰菊酯為唯一碳源進行生長，降解氯氰菊酯的最適溫度是35 ℃,最佳pH是7.0。結論 菌株J2是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株。

【關鍵詞】  氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解
　　
　　Abstract:Objective To isolate a bacterial strain J2 capable of degrading cypermethrin from sludge of a pesticide manufacturer.Methods Adopting selective culture to screen and isolate the cypermethrindegrading strain from the samples and identifying the strain by using the 16S rDNA sequence analysis and its taxonomic characteristics. Results This bacterial strain was identified as Klebsiella sp. named J2.It could grow with cypermethrin as sole source of carbon .The optimal temperature and pH of cypermethrin degradation by the organism were 35 ℃ and 7.0.Conclusion The bacterial strain J2 effectively degrade cypermethrin.

　　Key words:cypermethrin；Klebsiella sp. J2；biodegradation

　　隨著20世紀80年代無機鹽農藥和有機氯農藥的相繼禁用，菊酯類農藥已發展為我國現階段使用最廣泛的農藥之一，由於具有廣譜、內吸、觸殺等高效殺蟲特性，因此廣受農業生產者歡迎。但是，大量使用引起的農藥殘留不僅造成環境與食品的汙染，而且影響農產品的質量及人們的身體健康。農藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學降解和光降解等方式。與其他的降解方式相比，微生物降解具有操作簡單、降解徹底、無二次汙染等優點。因此利用微生物技術處理農藥殘留，並對受汙染的土壤與水體進行生物修複是一種行之有效的方法。目前對有機磷和有機氯等農藥的微生物降解的研究比較多，而關於菊酯類農藥的降解研究較少。本文從農藥廠的汙泥中采集土壤樣品，篩選分離到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J2），並對其進行篩選、鑒定及降解性能的初步研究［13］。

　　1材料與方法

　　1.1培養基
      
　　富集培養基（1 L）：蛋白腖10 g、NaCl 2.0 g、KH2PO4 1.5 g、葡萄糖1.0 g、dH2O 1 000 mL，pH值7.0；經115 ℃，滅菌20 min。基本培養基（1 L）：NH4Cl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.5 g ，加入氯氰菊酯作為唯一碳源，濃度視需要添加。LB液體培養基（1 L）：蛋白腖 10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 5 g，pH值7.0（固體加2%的瓊脂粉）。

　　1.2實驗試劑
   
　　氯氰菊酯（質量分數95%）原藥和標準品（質量分數99.9 %，色譜純）購自成都化學試劑公司；Taq DNA聚合酶與各種限製性內切酶均購自大連寶生物；3S DNA Gel Purification kit V3.1 購自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上betway必威西汉姆联亞合成；pMD18T載體試劑盒購自大連寶生物。

　　1.3降解菌株的富集和分離
   
　　將采集的農藥汙染土樣配製成15%的懸浮液，以5%的接種量接到含25 mg/L氯氰菊酯的富集培養基中，並加適量玻璃珠，37 ℃、160 r/min振蕩培養。待菌長出後，取1 mL菌液接入同樣培養基中37 ℃培養，傳代過程中氯氰菊酯的濃度逐步增高至300 mg/L,大約2 d傳代1次。將富集的農藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5 、10-6）稀釋，分別取0.2 mL懸液塗布在含有50 mg/L氯氰菊酯的無機鹽固體培養基上，37 ℃培養；當平板出現菌落時，將單菌落在無機鹽農藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長快、菌落規則、傳代穩定的單菌落斜麵保存。將初篩純化的斜麵單菌落接入含有50 mg/L氯氰菊酯的無機鹽液體培養基,37 ℃、160 r/min培養2 d，測定其降解率。

　　1.4菌株的鑒定
   
　　菌株的形態及生理生化特性參照文獻［4,5］進行，並采用bioMerieux Vitek全自動微生物分析係統進行鑒定，菌株16S rDNA的克隆及序列測定和比較參照文獻［6］，提取J2的基因組DNA作為模板，進行菌株J2的16S rDNA擴增，PCR引物分別為：引物1：5’AGACTTTGATCCTGGCTCAG—3’； 引物2：5’CGGCTACCTTGTTACGACTTC3’； 25 μL的體係為：模板DNA 1 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，上、下遊引物各1 μL，10×擴增緩衝液（含Mg2+）2.5μL，Taq酶（5U/μL）0.51μL，ddH2O 18 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s ，52 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循環30次；72 ℃ 延伸8 min。用PCR回收試劑盒回收16S rDNA片段並連接到T載體上，轉化到大腸杆菌DH5α，進行藍白斑篩選；挑選白斑菌落進行插入片段的酶切驗證；測序由上betway必威西汉姆联亞公司完成。測序結果在NCBI網站上通過blastn軟件與GeneBank中的16S rDNA序列進行同源性分析比較。

　　1.5氯氰菊酯含量的測定［7-9］
   
　　采用氣相色譜法，取培養液3 mL，移入10 mL具塞刻度試管，分別加入5 mL的石油醚，劇烈震蕩10 min，靜置2 h，重複2次，取上層有機相加入無水硫酸鈉吸水，並定容，再用氣相色譜儀（VARIAN CP3800）檢測。檢測條件：檢測器為FID，柱HP5（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫采用程序升溫，起始溫度150 ℃，以30 ℃/min升溫至250 ℃，保持15 min，載氣為氮氣（體積分數99.999%）,流量為40 mL/min，進樣量為0.8 μL,FID檢測器溫度290 ℃，進樣口溫度260 ℃，分流比為50。氯氰菊酯的降解率按下式計算：降解率=對照樣品殘留量－處理樣品殘留量 對照樣品殘留量其中，對照為不接降解菌或不加降解酶的同樣反應體係。

　　1.6菌株培養
   
　　從 4 ℃保存的J2菌株斜麵接一環於LB液體培養基，37 ℃搖床培養10 h左右，以此為種子液（OD600控製在1.5左右，下同）。菌體生長量的測定：準確量取10 mL培養菌液於已稱重的EP管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,用無菌dH2O洗滌2次,小心去上清,所得的菌體在85 ℃烘烤箱中烘至恒重，電子分析天平稱重。

　　2結 果

　　2.1高效降解菌的分離和篩選
   
　　采集樣品3份，經富集和馴化，將樣品稀釋後塗布於選擇性培養基平板上進行分離，選擇平板上共篩選到7株細菌。將這7株細菌分別接種於含有50 mg/L氯氰菊酯的無機鹽液體培養基中,37 ℃培養24 h後，測定氯氰菊酯的降解率，其中菌株J2對氯氰菊酯的降解率最高(94.2%),見表1。

　　表1分離的細菌菌株對氯氰菊酯的降解率　略

　　2.2高效降解菌株的初步鑒定
   
　　該降解菌株屬革蘭陰性菌，兼性厭氧菌，呈球杆狀，單個或短鏈狀排列，長0.9～1.2 μm, 寬2.1～2.5 μm，不形成芽孢，有莢膜。在LB培養基培養12 h的菌落直徑為0.5 mm，呈半球形，半透明，濕潤，表麵光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發酵葡萄糖產酸產氣；甲基紅實驗呈陰性；VP反應顯陽性；三糖鐵瓊脂試驗不產生H2S；其他生理生化特性見表2。

2.3菌株16S rDNA的序列分析
   
　　以菌株J2的基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度為1 514 bp的擴增產物（見圖1），測序後在GenBank上登錄，登錄號為AY989899。根據同源性比較，菌株J2與Genebank中的Klebsiella pneumoniae strain 2 (登錄號為DQ444287.1)和Klebsiella pneumoniae strain mcp11 d(登錄號為EF419182.1)  的同源性為99%。因此根據以上形態特征和生理生化特性,參照《伯傑氏細菌鑒定手冊》(第8版)［10］以及16S rDNA序列同源性比較結果,將菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J2。

　　表2分離株J2的部分生理生化特性　略

　　圖1菌株J2的16S rDNA　略

　　2.4氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響
   
　　在無機鹽培養基中加入氯氰菊酯，使其終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L。按種子培養液2%的接種量接種，每個處理重複3次,37 ℃下160 r/min培養2 d，取樣10 mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見圖2。從圖2可知，當氯氰菊酯濃度低於200 mg/L時，菌株Klebsiella sp.J2可以對氯氰菊酯進行降解；同時，隨著氯氰菊酯濃度的提高，其生長也逐步提高，在200 mg/L時達到最大值；而當氯氰菊酯濃度超過250 mg/L時，菌株Klebsiella  sp.J2細胞由於受到氯氰菊酯毒性的作用，菌體的生長受到抑製，因此，菌株的生長和對氯氰菊酯的降解隨之下降，到400 mg/L時基本不能生長，降解率也趨於零。

　　圖2氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響　略

　　2.5溫度對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響
   
　　按種子培養液2 %的接種量接種於內含100 mg/L氯氰菊酯的無機鹽培養基中,分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下160 r/min培養2 d,每個處理重複３次，分別取樣10 mL，測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見圖3。從圖3可知，在25～45 ℃之間，菌株Klebsiella sp.J2生長和降解氯氰菊酯的效果較好，其中以35 ℃時最佳，氯氰菊酯降解率達95.21 %；在25 ℃以下及45 ℃以上時，菌體生長較慢，氯氰菊酯降解率有不同程度的下降。

　　圖3溫度對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響　略

　　2.6 pH對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響
   
　　測定pH在5.0-10.0之間對菌株降解率的影響。分別配製pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸氫二鈉檸檬酸緩衝液和甘氨酸氫氧化鈉緩衝液，加入NaNO3、KCl滅菌，冷卻後合並，分開滅菌的CaCl2、MgSO4·7H2O，使用前加入100 mg/L的氯氰菊酯。按種子培養液2%的接種量接種，每個處理重複３次,37℃下160 r/min培養2 d後，取樣10 mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見圖4。從圖4可知，在pH 5.5-7.5之間，菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能比較好，最適pH為7.0，降解率為96.11%。
   
　　圖4pH對菌株Klebsiella sp.J2的生長和降解效能的影響　略

　　2.7菌株Klebsiella sp.J2的降解底物譜研究
   
　　按種子培養液2%的接種量接種於含100 mg/L不同菊酯類農藥和1 %葡萄糖的無機鹽培養基中,於37 ℃下160 r/min培養2 d後,取樣10 mL測定菌體生物量和不同菊酯類農藥的降解率，結果見表3。從表3可知, 菌株Klebsiella sp.J2對各種菊酯類農藥都有比較好的降解能力,特別是對氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明顯,而對氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯的降解作用則不明顯。

　　表3菌株Klebsiella sp.J2的降解底物譜研究　略

3結 論
   
　　通過富集培養從農藥廠的汙泥中分離到一株能以氯氰菊酯為唯一碳源生長且能將其高效降解的細菌，經生理生化試驗及16S rDNA初步鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J2;對降解菌Klebsiella sp.J2的生長和降解條件進行了初步的研究，該菌株降解氯氰菊酯的最適溫度是35 ℃,最佳pH是7.0;降解菌Klebsiella sp.J2還能降解甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯等多種菊酯類農藥。
   
　　4討 論
   
　　為了分離特定農藥的降解菌，富集時以這種農藥為唯一碳源和能源，隻添加必要的無機鹽，在特定生長條件下（即在某一選擇壓力下）長期培養微生物，在此條件下生長並且占優勢的微生物一定能夠分解利用此條件中的營養物質。按照這一原理設計富集培養基，從長期受菊酯農藥汙染的土壤中采集樣品，以此富集培養基連續富集馴化，在此培養基中生長的微生物即能利用氯氰菊酯作為碳源進行生長，並在培養環境中占據優勢。
   
　　本文初步分析了不同的外界條件對菌株的降解效能的影響。結果表明，菌株對這些條件都有一個適宜的適應範圍，在此範圍內具有較好的降解力，超出了這個範圍，菌株的降解效能就受到影響。不同的條件具有不同的效果，這可能是由菌株的生理結構及特性所決定的。因此在降解菌的開發利用過程中，應該綜合考慮到這些因素的影響，並合理利用，以充分發揮菌株的降解效能。

作者：梁衛驅,劉玉煥,李荷《廣東藥學學報》

【參考文獻】
  　［1］ 朱雲鑫.中國統計年鑒2001［M］.北京：中國統計出版社,2002: 83.
　　［2］ 曲格平.中國環境問題與對策［M］.北京：中國環境科學出版社,1987:168.
　　［3］ MALONEY S E ,MAULE A ,SMITH A R W,et al. Microbial transformation of the pyrethroid insecticides:permethrin,deltamethrin,permethrin,deltamethrin,fastac,fenvalerate and fluvalinate ［J］.Appl Environ Microbiol，1988,54(11):2874-2876.
　  ［4］ 範秀容，李廣武，沈萍.微生物學實驗［M］:2版.北京:高等教育出版社，1989:51-60.
　 ［5］ 周德慶.微生物學實驗手冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1986:16-36.
　 ［6］ LANE D J. 16S/23S rRNA sequencing, nucleic acid techniques in bacterial systematics［M］.New York:John Wiley & Sons Ltd,1991:115-175.
　 ［7］ 王兆守,林　淦,李秀仙,等.擬除蟲菊酯降解菌的分離、篩選及鑒定［J］.福建農林大學學報:自然科學版,2003,32(2):176-180.
　　［8］ 買光熙，劉瀟威，陳勇,等.毛細管氣相色譜法同時測定蘋果、梨中氯氰菊酯、聯苯菊酯和氟氯氰菊酯的殘留量［J］.農業環境保護，2002，21(3):260-275.
　　［9］ 丁海濤,李順鵬.擬除蟲菊酯類農藥殘留降解菌的篩選及其生理特性的研究［J］.土壤學報,2003,40(1):123-129.
　　［10］ BUCHANAN R E, GIBBONS N E. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) ［M］. Baltimore:The Williams and Wilkins Co.Baltimore Md,1984:446-450.

上一篇：對當前我國細菌抗菌藥敏試驗的建議

下一篇：臨床分離鑒定435株念珠菌及藥敏結果分析