地錢愈傷組織的誘導及其細胞培養條件的建立

【摘要】  目的 探計對地錢愈傷組織的誘導和懸浮細胞培養的條件。方法 用MSK2和MS培養基對地錢配子體進行愈傷組織誘導，運用模糊評判對MSK2培養基生長激素組合進行綜合性狀評價。結果 MSK2和MS（2mg/L 6BA）均能誘導出地錢愈傷組織，其中MSK2的誘導效果較好。光照（3000～8000 lux）能有效地促進地錢愈傷組織生長。激素配比組合是0.5mg/L 2,4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA適合於地錢細胞生長以及次生代謝生產。 結論 地錢愈傷組織的誘導成功和懸浮細胞培養條件的建立，為探索藥用苔蘚植物次生代謝產物生產提供新的途徑以及對苔蘚植物細胞規模化培養提供新的理論指導。 
【關鍵詞】  苔蘚；地錢；愈傷組織；植物細胞培養

　　To induce callus tissues and establish suspension culture of Marchantia polymorpha L. Methods  MSK2 and MS mediums were used to induce gametophytes into callus tissues, and the fuzzy comprehensive

 evaluation method was used to assess the optimal phytohormone combination. Results  Both MSK2 and MS (2mg/L 6BA) mediums  could induce callus tissue formation, and the MSK2 medium was superior to the MS medium for callus tissue induction. Light intensity（30008000 lux） effectively promoted the callus tissue growth. Optimal phytohormone combination for cell 

growth and secondary metabolism production was 0.5mg/L 2, 4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA. Conclusions  Successful induction of the callus tissues and establishment of suspension culture 

of Marchantia polymorpha L. provide a new pathway for exploring the pharmaceutical moss to 

produce secondary metabolism and new theory guidance  for suspension culture of moss cells 

on a large scale.
　　Key words: Bryophyte; Marchantia polymorpha L.; Callus tissue; Cell culture 
　　1  材料與方法
　　1.1  實驗材料
　　1.1.1  無菌材料獲得及愈傷組織誘導 
　　實驗所用的地錢（Marchantia  polymorpha L.）配子體由本實驗室提供。將培養在溫室內地錢上的濕沙洗掉，流水衝洗2h，在無菌室內用無菌濾紙吸幹，剪成0.5cm塊狀，放入7% NaClO消毒2min，無菌水衝洗3次，於培養溫度為25?℃，光照時間12h/d，光強為5000lux的條件下。采用MS、MS（2mg/L 6BA）和MSK2［7］作為愈傷組織誘導培養基。以上培養基均添加0.9%瓊脂，在高溫滅菌前pH值調至5.8。
　　1.1.2  懸浮培養條件的建立 
　　懸浮細胞經液體培養基繼代培養5代以上，作為細胞種子。選取MSK2、MS、KNOP、White、B5、Miller、1/2MSK2和1/2MS等用於篩選懸浮細胞培養基，將篩選得到對細胞生長良好培養基進行激素2,4D、NAA和 6BA（濃度0.5、1和2mg/L）組合優化，以求建立對細胞生長和次生代謝合成均為有利的懸浮培養條件。第20d取樣進行各生化指標測定，重複3次。
　　1.2  實驗方法
　　1.2.1  光照強度的設定 
　　將固體培養愈傷細胞置於培養溫度25?℃，光照時間12h/d HPG350HX智能型植物生長培養箱（黑龍江哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）內，分別設定光照強度0、3000、5000和8000 lux來考察光照對細胞生長的影響。
　　1.2.2  pH的測定 
　　采用PHS2型精密酸度計(上海雷磁儀表廠)測定。
　　1.2.3  葉綠素(chlorophyll)含量的測定 
　　采用丙酮乙醇混合液法測葉綠素含量［8］。將10mL懸浮地錢細胞經3000r/min離心後，置於6mL丙酮和無水乙醇等比例混合浸提液中，放於暗處，室溫下進行浸提，652nm處測定光密度，葉綠素含量用mg/g或mg/L表示。
　　1.2.4  細胞膜通透性的測定 
　　采用伊文思藍（Evans blue）染色法［9］。取1g鮮細胞，用0.5mL 0.05%的伊文斯蘭溶液將細胞染色5min後，PBS洗3次,以除去剩餘染料，然後用含1% SDS（w/v）的50%（v/v）甲醇於50℃下水浴30min，以抽提藍色染料，在600nm下測定吸光值。
　　1.2.5  酚類積累的測定 
　　取2mL培養基濾液，加入10mL乙酸乙酯，超聲振蕩後靜止萃取2h，取5mL乙酸乙酯組分自然風幹後，殘留物溶於3mL 75% 乙醇中，在280nm下測量其吸光度，以3mL 75% 乙醇為對照，以水楊酸為標準，以1μg水楊酸在280nm處的吸光度代表一個單位的酚積累［10］。
　　1.2.6  生化指標綜合評價 
　　采用模糊隸屬法用多項指標對激素配比組合進行綜合評價：其中：U={U1，U2……Un}為評價因素集，Rij(i=1，2……m；j=1，2……n)為評價值，i為處理，j代表各生物學性狀。將各測得到的數據按公式Rij=(Rij-Rjmin)/(Rjmax-Rjmin)處理，Rjmin—指J性狀中最小值；Rjmax—指J性狀中最大值，得到評判模糊矩陣R。按照各性狀的重要性確立各因素的權重，得權重分配集A，使權重滿足歸一化要求∑ni=1Wi=1，通過矩陣運算 B= R•AT。
　　1.3  統計學處理
　　所有數據均以±s表示，應用SAS統計學軟件進行方差分析，采用t檢驗進行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。
　　2  結  果
　　2.1  地錢愈傷組織的誘導和懸浮細胞培養 
　　見圖1。由圖1可見。MSK2培養基第15?d就可見在地錢配子體周圍已有深綠色愈傷組織產生，愈傷組織呈凝聚狀，不斷增多，並向培養基四周擴展及培養基內滲入，配子體不斷縮小而愈傷組織愈來愈多。同樣，培養在MS（2mg/L 6BA）中的地錢配子體周圍也產生淺綠色的愈傷組織，隻是其配子體縮小緩慢，愈傷細胞生物量沒有MSK2培養基多。而在MS培養基的配子體第20d仍未見愈傷組織的產生。
　　2.2  光強對地錢愈傷組織生長的影響 
　　見表1。由表1可見，在光照3000、5000和8000lux條件下，地錢愈傷細胞生物量顯著高於未光照條件下地錢愈傷細胞生物量（n=3, P＜0.05）。
　　2.3  不同培養基對地錢懸浮細胞生長和葉綠素含量的影響 
 
　　見表2。由表2可見，KNOP培養基細胞生物量最高，其次是MSK2，次之是MS培養基，而Miller等培養基的細胞生物量則要顯著低於上述3種培養基（n=3, P＜0.05）。其中稀釋培養基1/2MSK2和1/2MS培養基的細胞生物量則分別低於MSK2和MS培養基（n=3, P＜0.01）。
    MSK2培養基生物量高於除KNOP外的其他培養基，其葉綠素含量3.93g/L高於KNOP、Miller和MS等培養基（n=3, P＜0.05）。另外，MSK2培養基誘導愈傷組織的效果比MS（2mg/L 6BA）培養基要好（圖1），因此本研究在MSK2培養基基礎上，對其激素2,4D、NAA和 6BA進行不同比例組合優化，以求建立對細胞生長和次生代謝生產都較為有利的培養條件。
　　2.4  不同激素組合對地錢細胞生長及次生代謝的影響 
　　見表3。由表3可見，表中序號1和3細胞生物量高於序號10 ［MSK2（n=3, P＜0.05）］，序號6、7、8和9要低於序號10（n=3, P＜0.05），而序號2、4和5細胞生物量與序號10沒有區別。同樣，對於葉綠素含量來說，序號1和4葉綠素含量極顯著高於序號10（n=3, P＜0.01），序號2、3、5、6和8葉綠素含量則顯著高於序號10（n=3, P＜0.05），剩下的序號7和9葉綠素含量則要低於序號10（n=3, P＜0.05）。
    對次生代謝多酚含量來說，序號2、3、4、5、6、8和9多酚含量要高於序號10（n=3,P＜0.05），而序號1和7多酚含量與序號10差異不明顯。
 
2.5  各評價因素權重 
　　按照各性狀的重要性確立各因素的權重，權重分配集A=（0.75，0.02，0.05，0.03，0.2）T。
　　2.6  評價單元各評價因素的隸屬度與綜合評價指數 
　　見表4。由表4可見，序號3綜合係數最大為0.8413，其次是序號1，其綜合係數為0.8236。最小的是序號6，其綜合係數為0.2199。
　　3  討  論
    本試驗結果表明，地錢配子體在第15?d就誘導愈傷組織，步聚簡單，一步即可完成，減少了汙染機會，優於文獻報道的方法［11］。本試驗結果可為其他苔類及苔蘚植物細胞培養提供理論依據。
    光是調控植物生長發育的一個有效影響因子，高光強有利於配子體啟動並促進其誘導愈傷組織。本試驗結果表明，地錢愈傷組織細胞受到光照後，有利於增加葉綠素含量和光合效率，促進了細胞物質的吸收和代謝活動，有利於細胞增埴，細胞呈鮮綠色，並很快長滿培養基質，第20d後培養基上已長滿一厚層的愈傷組織。但是光強過強容易造成細胞光過氧化和破壞細胞葉綠體結構而降低光合效率，不利於細胞增殖。雖然細胞在無光源照射條件仍能生長，但是細胞細疏，顏色淡黃，其生物量顯著低於光照培養（n=3, P＜0.01），並且葉綠素含量也低於有光照條件（n=3, P＜0.01）。
    
　　雖然KNOP培養基生物量是最高的，但其葉綠素含量0.13mg/L顯著低於MSK2培養基的3.93mg/L和MS培養基的1.33mg/L，而且KNOP培養基細胞在第20d呈灰色，表明此時細胞進行光合作用作用較差，因此不適宜對地錢愈傷細胞進行培養。稀釋一倍的1/2MS和1/2MSK2的生物量也不如MSK2和MS的好，故也不利於懸浮細胞增殖培養。
    MSK2培養基生物量僅低於KNOP培養基，而其葉綠素含量顯著高於KNOP、Miller和MS等培養基（n=3, P＜0.05）。MSK2培養基誘導愈傷組織的效果優於MS（2mg/L 6BA）培養基，因此本研究選擇使用MSK2培養基對地錢細胞進行懸浮培養。
    
　　因MSK2培養基隻含有2，4D一種植物激素，比較單一［1213］。植物生長激素是最有效地調控細胞生長的化學物質，若按一定比例組合可以達到增效作用，從而更好地調控植物細胞的生長，因此本研究對主要激素配比進行了優化處理。結果表明，激素配比組合序號1和3對細胞的生長最為有利，但它們細胞的其它生物學性狀在各自同一生化指標中並不是最好，說明僅從生物量來選擇培養基不是很準確。因此，本研究在建立不同激素配比組合為主的細胞培養體係時，既考慮生物量的同時也兼顧與生物量和次生代謝相關的一些事件（pH、葉綠素含量、膜通透性和多酚），並運用模糊數學的方法對這些生化指標進行綜合評判。模糊綜合評價分析法不僅考慮生物量，同時還考慮與細胞生長和次生代謝相關的多個性狀指標，較為全麵地綜合分析和評價各激素比例組合，具有可靠性和客觀性。
本試驗評價要素主要包括生物量以及與生物量和次生代謝有關的生物學性狀：如葉綠素、膜通透性、pH和多酚。將各項指標的隸屬函數的數值之和視為激素配比組合綜合評價值，評價值大，配比組合效應好，反之評價值小，綜合配比組合差。序號3的綜合係數最大，其生物量與序號1沒有顯著差異，其次生代謝顯著高於對照序號10，其葉綠素含量和膜通透性適中，有利於以後對細胞進行操作。因此確定，適合於地錢細胞生長和次生代謝的培養基激素配比組合是0.5mg/L 2,4D+2mg/L NAA+2mg/L 6BA，這為其他苔蘚植物細胞規模化培養提供了理論依據和指導。
作者：尹德明，溫學森，婁紅《山東大學學報》
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