嗜酸乳杆菌對螺旋形和球形幽門螺杆菌黏附拮抗作用的研究

【摘要】  目的 研究熱滅活狀態和活菌狀態嗜酸乳杆菌對螺旋形和球形幽門螺杆菌(Hp)的黏附拮抗作用。方法 製備人胃上皮腺癌細胞係（AGS）細胞爬片，將兩種狀態嗜酸乳杆菌和不同形態Hp菌分組按不同順序加入，作用2 h，革蘭染色後光鏡觀察分析Hp黏附指數產生的變化，熒光抗體染色法定性評價黏附於AGS細胞的Hp密度的改變。 結果 革蘭染色後光鏡觀察分析：排除實驗組及競爭實驗組與對照組比較，黏附指數均有明顯下降（P<0.05）。熒光鏡下可見實驗組黏附於細胞的Hp密度也明顯降低。 結論嗜酸乳杆菌對不同形態的Hp均具有黏附拮抗作用。

【關鍵詞】  乳杆菌,嗜酸;螺杆菌,幽門;上皮細胞;胃腫瘤;細菌黏附;熒光抗體技術

The Antagonism Effect of Lactobacillus Acidophilus on Adherence of Helical and Coccoid Forms of Helicobacter pylori

　　WU Xiaoqian, SHE Feifei, LI Neng,CHEN Yuexiu

　　Department of Pathogeny Biology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the antagonism effect on adherence of the helical and coccoid forms of Hp to the gastric epithelial cell by the inactivated and living Lactobacillus acidophilus.  Methods  The AGS cellseeded coverslips were prepared, then the two different status of Lactobacillus acidophilus and two different forms of Hp were added in different order. 2 hours later, the bacteria were Garm's stained, and the adherence of Hp to AGS cell were observed by microscope and the adherence index was calculated. At the same time, by using FITCconjuncted antibody, the density of the adhered two different forms of Hp was evaluated under the fluoscence microscope after treatment with inactivated and living Lactobacillus acidophilus.   Result  Compared with the control group, the adherence indexes of the competition test group and the exclusion test group were much lower（P<0.05）, and the density of the adhered two different forms Hp of test groups were much lower than that of the control group.  Conclusion   Lactobacillus acidophilus had antagonism effect on cell adherence of helical and coccoid forms of Hp.
     幽門螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)存在2種形態：螺旋野生形和球形變異形。在不利於其生長繁殖的環境中，螺旋形Hp可轉變為球形。球形Hp在細菌的傳播及致病中也起著重要作用。筆者擬從細菌感染的第一步，即嗜酸乳杆菌對2種形態Hp的黏附能力的影響探討將嗜酸乳杆菌同時作為預防和治療Hp感染常規輔助手段的可行性。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株與培養 

　　嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus標準株6075源自中國工業微生物菌種保藏中心。Hp國際標準株NCTC11637為本係保存。

　　1.1.1  嗜酸乳杆菌製備 

　　采用MRS液體培養基在厭氧環境下37 ℃靜止培養36 h，收集菌液分為活菌和滅活2組，滅活組經75 ℃水浴滅活30 min。無血清無雙抗的F12高糖培養液重懸。

　　1.1.2  螺旋形Hp製備 

　　用含5%新鮮脫纖維羊血的布氏血平板上（含萬古黴素10 μg/mL，多粘菌素B  2.5 IU/mL，TMP  5 μg/mL），37 ℃微氧環境中培養和傳代。傳代後再培養2 d的螺旋形Hp以PBS洗下，無血清無雙抗的F12高糖培養液重懸。

　　1.1.3  球形Hp製備 

　　將Hp傳代後再培養2 d，用布氏肉湯（含10%小牛血清）洗下細菌，製成菌懸液。加入滅滴靈（終濃度8 μg/mL），37 ℃微氧環境培養，直至Hp全部轉為球形（約60 h）。經顯微鏡下觀察及再培養無菌生長，確定為Hp已完全球變。以無血清無雙抗的F12高糖培養液重懸細菌備用。

　　1.2 細胞培養和細胞爬片製備 

　　人胃上皮腺癌細胞係AGS細胞由本係保存，培養液為含10%胎牛血清的F12高糖培養液（含10%胎牛血清，青黴素200 IU/mL，鏈黴素50 μg/mL）。置於體積分數為0.05的CO2培養箱中培養，隔天傳代，實驗所用細胞均處於對數生長期。於6孔板內置蓋玻片，每孔接種1×105 mL-1密度的細胞液2 mL，過夜培養，製成爬片。

　　1.3 兔抗Hp11637多克隆抗體製備 

　　超聲粉碎菌體後，自家兔耳緣靜脈隔周免疫4次後抽心髒血製備血清。間接ELISA法檢測抗體的效價：以Hp11637超聲抗原包被96孔酶聯板，對待測血清進行1∶100～1∶51 200倍比稀釋後檢測。Western blot檢測抗體的相對特異性：將嗜酸乳杆菌6075裂解物行SDSPAGE電泳，以待測血清做一抗。

　　1.4  不同狀態嗜酸乳杆菌對螺旋形和球形Hp黏附拮抗研究

　　1.4.1  光鏡觀察並計算黏附指數

　　1.4.1.1  觀察分析不同狀態的嗜酸乳杆菌對AGS細胞的黏附情況 

　　將活菌和熱滅活狀態的嗜酸乳杆菌加入6孔培養板中，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用2 h。每孔菌液2 mL，細菌濃度為5×107 CFU/mL。作用完畢後，取出細胞爬片，PBS洗3次，常規革蘭染色後於油鏡下觀察並隨機計數50個細胞上活菌或熱滅活狀態的嗜酸乳杆菌的黏附數量。推算出每個上皮細胞的黏附指數：

黏附指數=黏附嗜酸乳杆菌數/細胞數

　　1.4.1.2  通過排除、競爭、替換實驗觀察分析不同狀態的嗜酸乳杆菌對螺旋形和球形Hp黏附能力的影響 

　　（1）排除實驗組：將活菌和熱滅活狀態的嗜酸乳杆菌加入6孔培養板中，在37 ℃，體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用1 h，去除未黏附的嗜酸乳杆菌,然後再分別加入螺旋形Hp、球形Hp懸液，繼續孵育1 h；(2)競爭實驗組：分別將螺旋形Hp、球形Hp懸液與嗜酸乳杆菌活菌組或滅活組懸液同時加入6孔培養板中混勻，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用2 h；(3)替換實驗組：將螺旋形Hp、球形Hp懸液加入6孔板中，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用1 h後，去除未黏附的螺旋形Hp、球形Hp，再加入活菌和熱滅活狀態的嗜酸乳杆菌懸液，混勻後繼續孵育1 h。(4)對照組：將螺旋形Hp、球形Hp懸液加入6孔板中，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環境中與AGS細胞作用2 h。每孔菌液2 mL，每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分別達到108 個。作用完畢後，取出細胞爬片，PBS洗3次，常規革蘭染色後於油鏡下觀察並隨機計數50個細胞上螺旋形Hp、球形Hp的黏附數量。推算出每個上皮細胞的黏附指數:

    黏附指數=黏附螺旋形Hp或球形Hp數/細胞數

　　1.4.2  熒光抗體染色法定性評價嗜酸乳杆菌的加入對不同形態 Hp 黏附細胞的密度影響 

　　將製備的細胞爬片分組：螺旋形Hp組、球形Hp組，對照組、如
　　1.4.1.2的排除實驗組、競爭實驗組、替換實驗組。每孔菌液2 mL，除對照孔加2 mL無血清F12高糖培養液外，其餘各組每孔中嗜酸乳杆菌及Hp菌量分別達到108 個。螺旋形Hp組、球形Hp組及對照組孵育2 h，排除實驗組、競爭實驗組及替換實驗組孵育時間參照1.4.1.2。各組細胞片經PBS洗3次，兔抗11637多克隆抗體37 ℃作用30 min，PBS洗3次，用FITC標記的羊抗兔抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司）作用30 min，經洗滌封片後於熒光顯微鏡下觀察並拍照。實驗重複3次。

　　1.5  統計學處理 

　　黏附指數以x±s表示，采用SPSS 12.0統計軟件分析，比較采用成組t檢驗。

　　2 結果

　　2.1 不同狀態嗜酸乳杆菌對AGS細胞的黏附情況 

　　革蘭染色後油鏡下觀察可見：活菌狀態的嗜酸乳杆菌和滅活狀態的嗜酸乳杆菌均對AGS細胞具有較強的黏附活性。活菌狀態的嗜酸乳杆菌黏附指數（53.00±13.14）與滅活狀態的嗜酸乳杆菌黏附指數（42.00±11.47）比較，差別無統計學意義（P>0.05）。

　　2.2  不同狀態嗜酸乳杆菌對螺旋形和球形Hp細胞黏附指數的影響

　　2.2.1  不同狀態嗜酸乳杆菌對螺旋形Hp黏附AGS細胞的影響 

　　革蘭染色後油鏡下可見：螺旋形Hp對AGS細胞具有很強黏附活性。嗜酸乳杆菌先於Hp（排除實驗組）或同時與Hp（競爭實驗組，圖1A）加入細胞中，則螺旋形Hp對AGS細胞的黏附指數明顯下降（P<0.05）。若嗜酸乳杆菌後於Hp（替換實驗組）加入細胞中，則螺旋形Hp對AGS細胞的黏附指數無明顯變化（P>0.05）。同一實驗組中，加入滅活狀態的嗜酸乳杆菌組與加入活菌組比較，其Hp對AGS細胞的黏附指數均較低，差別無統計學意義（P>0.05，表1）。表1  不同狀態嗜酸乳杆菌對螺旋形Hp黏附AGS細胞的影響（略）

　　2.2.2  不同狀態嗜酸乳杆菌對球形Hp黏附AGS細胞的影響 

　　革蘭染色後油鏡下可見：球形Hp雖然黏附能力略有下降，但仍保持較強黏附活性。嗜酸乳杆菌先於Hp（排除實驗組）或同時與Hp（競爭實驗組，圖1B）加入細胞中，則球形Hp對AGS細胞的黏附指數明顯下降（P<0.05）。若嗜酸乳杆菌後於Hp（替換實驗組）加入細胞中，則球形Hp對AGS細胞的黏附指數無明顯變化（P>0.05）。同一實驗組中，加入滅活狀態的嗜酸乳杆菌組與加入活菌組比較，其Hp對AGS細胞的黏附指數均較低，差別無統計學意義（P>0.05，表2）。

　　2.3  熒光抗體染色法定性評價嗜酸乳杆菌的加入對不同形態 Hp 黏附細胞的密度影響 

　　ELISA結果顯示：血清抗體效價為1∶12 800；Westernblot結果顯示：Hp11637裂解物出現多條條帶，而嗜酸乳杆菌6075裂解物則未出現條帶，無交叉反應。表明製備的血清抗體可用。熒光顯微鏡下可見，螺旋形及球形Hp均能夠高密度的黏附於AGS細胞上，螺旋形Hp的熒光強度略高於球形Hp。加入不同形態的嗜酸乳杆菌後，排除實驗組與競爭實驗組中螺旋形及球形Hp的黏附密度有明顯降低（圖2）。表 2  不同狀態嗜酸乳杆菌對球形Hp黏附AGS細胞的影響（略）

　　3 討 論

    作為可在胃內常駐的細菌，確切安全的微生態製劑之一，嗜酸乳杆菌對Hp抗炎抑製作用國內外已有相關報道。但其機製至今尚未明確，且研究也局限於螺旋形Hp[12]。

    多項研究預示球形Hp在Hp的傳播及致病甚至潛在致癌性中起著重要作用。有研究顯示抗生素治療後，球形Hp在胃中的潛伏是消化性疾病複發的重要原因之一[3]。流行病學調查顯示飲用水與Hp感染關係密切，支持Hp經水傳播的觀點[45]，而Hp在無營養的水中3～4 d後已全部轉變為球形菌[6]。有學者發現，胃癌組織中的Hp通常是以球形菌的形式存在，癌變胃組織中球形Hp的檢出率顯著高於潰瘍病患者[7]。球形Hp被證實保存了Hp的毒力和生存活力，在條件適宜時可轉化為螺旋形。因此在開發預防和根除治療Hp感染的方法時應同時考慮到其對抗球形Hp的作用，以預防球形Hp的侵入或清除體內球形Hp。

    黏附是細菌感染的第一步。Hp隻有黏附定植於胃上皮細胞表麵後，才能對抗胃的蠕動及排空而不被清除，並生長繁殖和致病。阻斷螺旋形及球形Hp黏附於胃黏膜上皮細胞，無疑能夠對預防其感染和根除治療起積極作用。本研究從球形和螺旋形Hp兩個角度入手，研究嗜酸乳杆菌的加入對兩種形態的Hp黏附胃上皮細胞作用產生的影響。

本研究結果顯示：活的嗜酸乳杆菌和滅活狀態乳酸菌對AGS細胞的黏附能力並沒有顯著差異。這與劉祥等用嗜酸乳杆菌臨床分離株與SGC7901胃上皮細胞作用後結果一致[8]。無論是對螺旋形還是球形Hp，滅活狀態的嗜酸乳杆菌的黏附抑製作用與活菌狀態比較均呈現減弱趨勢，提示除了菌體本身的因素外，嗜酸乳杆菌細胞外的代謝產物也可能部分影響Hp的黏附活性。替換實驗的結果顯示，一旦Hp先於嗜酸乳杆菌與上皮細胞接觸，則嗜酸乳杆菌的黏附抑製作用明顯減弱。提示競爭相同的細胞黏附表位是其抑製黏附的主要機製。本實驗中嗜酸乳杆菌對球形Hp也具有明顯的黏附抑製作用，預示其能有效阻斷外源或體內抗生素使用後誘發的球變Hp在胃內的定植。球形Hp仍然保持著較強的黏附胃上皮細胞的能力，這與球形Hp保存了Hp的毒力說法相符。光鏡下計數的黏附指數和熒光鏡下觀察可以看出，其對AGS的黏附活性略低於螺旋形，這可能與球形Hp的黏附因子的相對低表達有關。

作者：吳小茜，佘菲菲，李能，陳月秀

【參考文獻】
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　　[2] Zhou C,Ma F Z,Deng X J,et al. Lactobacilli inhibit interleukin8 production induced by Helicobacter pylori lipopolysaccharideactivated Tolllike receptor 4[J]. World J Gastroenterol, 2008,14(32):50905095.
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　　[6] 佘菲菲,朱 蘋,史碧山,等． 水中幽門螺杆菌的球形變異及其致病力[J]． 中華微生物學和免疫學雜誌, 2001,21（4）：395396.
　　[7] Chan W Y,Hui P K,Leung K N,et al. Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach[J]. Am J Clin Pathol, 1994,102：503507.
　　[8] 劉祥,潘素華,張朝武,等． 嗜酸乳杆菌胃分離株WR22體外抑製幽門螺杆菌黏附胃上皮細胞研究[J]． 中國人獸共患病學報, 2006,22（3）：246248.

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