耐氨苄西林流感嗜血杆菌產β-內酰胺酶機製研究

摘　要　目的：探討耐氨苄西林的流感嗜血杆菌產生β-內酰胺酶的機製。方法：對臨床分離的112株流感嗜血杆菌耐藥菌用紙片法作β-內酰胺酶測定，用PCR法檢測產酶流感嗜血杆菌中的β-內酰胺酶基因的存在。結果：紙片法測得產酶菌株32株，產酶率28.6％(32/112)；32株產酶菌中PCR法測β-內酰胺酶基因陽性菌株29株，陽性率為90.6%(29/32)，其中質粒DNA模板組陽性為25株，基因組DNA模板組陽性為4例。結論：(1)流感嗜血杆菌耐氨苄西林主要由質粒介導產生β-內酰胺酶所造成。(2)PCR法是研究流感嗜血杆菌是否攜帶β-內酰胺酶基因及該基因所在位置的簡便而有效的方法。

　　自1972年第一次發現流感嗜血杆菌因產β-內酰胺酶而致耐氨苄西林以來［1］，國外對耐氨苄西林流感嗜血杆菌的耐藥機製以及產β-內酰胺酶的分子基礎研究,呈逐年增加趨勢。1978年Bryan等［2］首次報道了質粒介導產生β-內酰胺酶的流感嗜血杆菌。此後，圍繞流感嗜血杆菌中的質粒編碼β-內酰胺酶及其與耐氨苄西林的關係進行了許多研究。我國由於流感嗜血杆菌的分離率較低，對此問題的研究一直沒有深入。本文作者在本實驗室成功提高流感嗜血杆菌分離率的基礎上［3,4］，分離獲得36株耐氨苄西林的流感嗜血杆菌，用紙片法測定它們產β-內酰胺酶的情況後，用PCR方法對產酶菌中β-內酰胺酶基因的存在與否進行了檢測，對耐氨苄西林的流感嗜血杆菌產生β-內酰胺酶機製作了初步分析。

　　1　材料和方法

　　1.1　流感嗜血杆菌的分離培養　收集痰或咽拭子標本，於1 h內接種於改良的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5% CO2孵箱，37℃孵育18～24 h,對疑似流感嗜血杆菌的菌落分別於血瓊脂和營養瓊脂平板上作衛星試驗，僅在血瓊脂平板上衛星試驗陽性者為流感嗜血杆菌。用常規的紙片法（K-B法）對每個菌株作體外藥物敏感試驗，根據美國NCCLS標準判讀藥敏結果。從平板上挑取耐氨苄西林的單菌落接種於含3 ml液體HTM培養液的試管中，於5% CO2孵箱37℃孵育培養過夜，離心收集菌體用於質粒製備等後續實驗。

　　1.2　紙片法測定β-內酰胺酶　將流感嗜血杆菌培養物經超聲裂解後直接塗布於β-內酰胺酶紙片上，在15 min內變紅者為陽性。超聲儀為Branson Sonifier 250，β-內酰胺酶紙片購自Oxid公司。

　　1.3　PCR法檢測β-內酰胺酶基因

　　1.3.1　PCR引物　針對β-內酰胺酶結構基因的PCR引物由本校分子遺傳學開放實驗室用PCGENE軟件PCRPLAN程序設計，上海生工生物工程公司協助合成。引物序列為：上遊引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下遊引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′。

　　1.3.2　PCR反應條件　用PE2400型DNA擴增儀,50 μl PCR反應體係中含有模板DNA 1 μl、上遊下遊引物各1 μl（濃度為25 μmol/L），10×緩衝液5 μl，dNTP混合物（10 mmol/L）4 μl，並用ddH2O補足至50 μl（Mg2+的終濃度為1.5 mmol/L），以94℃ 3 min→(94℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min，循環30次)→72℃ 7 min→4℃保溫。PCR反應後取10 μl產物點樣，進行瓊脂糖凝膠電泳並拍照。

　　1.3.3　PCR模板的製備　細菌質粒DNA用常規堿裂解法分離、RNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提純化［3］；細菌基因組DNA用菌體凍融法製備：取少量細菌於1.5 ml塑料離心管中，用蒸餾水重懸，加入少量溶菌酶於37℃水浴5 min，放入液氮迅速冰凍5 min，取出後立即放入37℃水箱融化5 min，重複凍融3次，室溫下1×104 r/min離心5 min，吸取上清液到新的離心管，加入1.5倍體積的無水乙醇於-20℃沉澱30 min，1.5×104 r/min離心沉澱，用10 μl TE溶解後備用。
　　2　結　果
　　2.1　流感嗜血杆菌的分離　自1997年10月至1998年11月,從我院呼吸內科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子標本，分離鑒定出112株流感嗜血杆菌,其中，藥敏試驗證明為氨苄西林耐藥的36株。
　　2.2　β-內酰胺酶檢測結果　36株耐氨苄西林流感嗜血杆菌中，紙片法測得產酶菌株32株，耐藥菌中產酶率88.9%(32/36)。
　　2.3　PCR法檢測β-內酰胺酶基因結果　用針對β-內酰胺酶基因的上遊和下遊特異性引物擴增後，陽性條帶大小為486 bp，擴增結果與預期值相同。32株產酶菌中PCR陽性菌株29株，陽性率為90.6%。其中以質粒為模板PCR陽性菌株25株，占產酶菌的78.1%（25/32)；對7株質粒DNA模板PCR陰性的菌株，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，結果有4株為陽性。
　　3　討　論
　　國外對耐氨苄西林流感嗜血杆菌產β-內酰胺酶的分子機製研究，主要采用的方法是在大量培養細菌的基礎上，通過CsCl密度梯度超離心等方法獲取較大量的質粒DNA，進行限製性內切酶酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳、質粒轉化試驗等，大致分析質粒DNA的大小、結構，驗證質粒介導的耐氨苄西林表型等，獲得質粒介導的產酶及其與耐氨苄西林藥物的關係等的可靠證據［6］。但是，自然狀態的流感嗜血杆菌菌株中所攜帶的野生型質粒的大小、結構、拷貝數差異非常大，對細菌培養的數量、質粒抽提純化的方法提出了很高的要求，其結構的變異也造成電泳、酶切分析等方法難以做到精確分析質粒的結構。另外，野生型質粒的分子量通常較大，常用的轉化實驗成功率不高；再加上野生型菌株中所含質粒結構複雜，而這些方法都未能直接鑒定質粒DNA中是否攜帶有編碼β-內酰胺酶的基因。

　　鑒於上述情況，本實驗設計了針對β-內酰胺酶基因的特異性引物，對所分離獲得的產β-內酰胺酶的耐氨苄西林流感嗜血杆菌中該酶編碼基因的存在情況進行了直接的PCR檢測。結果發現，32株產β-內酰胺酶的流感嗜血杆菌，用可靠的堿變性法獲取的質粒DNA為模板進行PCR檢測，陽性率達到78.1%，而7株質粒DNA模板PCR陰性的產酶菌株中，有4株在以染色體DNA樣品為模板進行的PCR反應中表現陽性。這些結果提示耐氨苄西林的流感嗜血杆菌編碼β-內酰胺酶的基因主要存在於所攜帶的質粒DNA上，而有少部分酶基因位於染色體DNA上，這與文獻報道的結論一致。從方法上看，本研究所采用的PCR法直接檢測耐氨苄西林流感嗜血杆菌中β-內酰胺酶基因的方法，特異性高，標本產β-內酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特異性；敏感性高，PCR方法可將待測DNA片斷的量擴大百萬倍，可以檢測細菌含量極微的標本；既可以測質粒模板β-內酰胺酶基因，也可以測染色體模板β-內酰胺酶基因；如果配合PCR產物的序列測定等，還可用於β-內酰胺酶分類、基因序列分析、分子流行病學調查等。但PCR方法有假陽性的情況，如β-內酰胺酶基因結構出現變異但未影響PCR引物結合位點時，可能存在PCR陽性但基因並無活性的情況。從理論上講，能產生β-內酰胺酶的菌株均應有相應的編碼基因存在，但本實驗中有3株PCR陰性，可能的原因是模板製備過程以及PCR反應過程所造成的假陰性所致。雖然國外有用PCR方法檢測流感嗜血杆菌菌株、β-內酰胺酶基因及其分類的報道［7］，國內袁藝等［8］曾用PCR法檢測流感嗜血杆菌菌株，但對產β-內酰胺酶的耐氨苄西林流感嗜血杆菌，分別以其質粒DNA和染色體DNA為模板，用PCR方法測β-內酰胺酶基因，研究其產酶和耐藥機製的，國內外均未見報道。

參考文獻
　　1　Gunn BA, Woodall JB, Jones JF, et al. Ampicillin-resistant haemophilus influenzae［J］. Lancet. 1974,2(7884): 845
　　2　Bryan  LE. Transferable chloramphenicol and ampicillin resistance in a strain of Haemophilus influenzae［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1978,14(1):154
　　3　修清玉，賴國祥，王桂芳，等. 改良哥倫比亞巧克力培養基分離流感嗜血杆菌［J］. 中華醫學檢驗雜誌， 1998，21(3):161
　　4　方　正，羅文侗，修清玉，等，流感嗜血杆菌下呼吸道感染的實驗與臨床研究［J］. 中華結核與呼吸雜誌, 1999,22(4):208
　　5　薩姆布魯克 J, 弗裏奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T. 金冬雁，黎孟楓 譯. 分子克隆實驗指南. 第2版［M］. 北京：科學出版社，1992. 19～24
　　6　Bajanca-Lavado MP, Casin I, Vaz-Pato MV. Antimicrobial resistance and epidemiological study of Haemophilus influenzae strains isolated in Portugal. The Multicentre Study Group［J］. J Antimicrob Chemother, 1996, 38(4):615
　　7　Tenover FC, Huang MB, Rasheed JK, et al. Development of PCR assays to detect ampicillin resistance genes in cerebrospinal fluid ample containing Haemophilus influenzae［J］. J Clin Microbiol, 1994, 32(11): 2729
　　8　袁　藝,盧　競，郭章溉，等. 聚合酶鏈反應技術檢測流感嗜血杆菌［J］. 中華微生物學與免疫學雜誌, 1997,17(1):25

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