流感嗜血杆菌的耐藥性及其耐藥機製

　　1  流感嗜血杆菌的一般情況
    　　
　　Hi分型研究的常用方法有生物型、血清型和莢膜型等多種，其中莢膜型/血清型對Hi致病性研究和菌苗研製意義重大。根據該菌細胞壁外莢膜多糖的有無，可將Hi分為有莢膜的可分型和無莢膜的不可分型兩類，前者再可根據其莢膜多糖抗原的不同，分為a、b、c、d、e、f 六個血清型。

　　研究表明不同年代、不同地區Hi血清型存在較大地區差異。用直接原位聚合酶鏈反應（ISPCR）雜交法，20世紀50～60年代Hib的檢出率是14.3%，80年代至2002年Hib的檢出率是20.5%［1］。陳民鈞等［2］用Hib型抗原乳膠凝集試驗對北京、上海和廣州地區的菌株進行研究，發現三個地區Hib分別占1.8%、32.3%和6.5%。之後報道北京2000年Hib檢出率是13.7%［3］，上海2003年是19%［4］。華春珍等［5］對247株Hi血清分型研究中不可分型菌株占61.9 %，可分型菌株占38.1%，其中可分型菌株中以d型為主，構成比達90.4%，b型僅1.1 %。
    　　
　　在國外，孟加拉國化膿性腦膜炎由Hi引起的占35%，這其中有97.1%為Hib感染［6］。意大利學者報道了1997～1998年分離的Hi菌株中b型占91.2%，f型占0.9%，不可分型占7.9%［7］，1998～1999年分離的Hi菌株均為Hib，2000～2001年在對7例病人標本進行追蹤檢測，其中有5株為e型［8］。波蘭學者從感染的下呼吸道分泌物中分離的Hi菌株中b型占40.3%，e型占38.9%，f型占16.7%，d型占4.1%［9］。
    　　
　　Hi作為流感時繼發感染的常見細菌，在我國尤其是兒童呼吸係統感染中占重要地位。不同型的菌株引起的疾病種類和感染宿主年齡不盡相同，其中b型致病力最強，對兒童常常危及生命。Hib可引起嚴重感染，但近些年來由於Hib疫苗的推廣使用，Hib感染率逐漸下降，而其它型及無莢膜型Hi感染日益增多。在美國，非b型菌株發病率有上升趨勢，在成人慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者及中耳炎患兒中的檢出率越來越高［10］。莢膜作為本菌的主要毒力因子，是產生致病性的主要原因。有莢膜株常引起肺炎、敗血症等侵襲性感染，而無莢膜株是引起兒童中耳炎和呼吸道感染的重要病原並且也可引起侵襲性感染，這與正常人呼吸道寄居者中絕大多數是無莢膜型相關聯。

　　2  流感嗜血杆菌對抗生素的耐藥現狀

　　2.1  Hi對β內酰胺類的耐藥性

　　2.1.1  青黴素類 

　　以氨苄西林為代表，氨苄西林在70年代作為治療該菌感染的首選藥，自1972年在歐洲首次發現Hi對氨苄西林耐藥後，世界各地相繼報道了其耐藥性，呈現出明顯的地區差別。我國國內各地報道不一，在4.8%～40.2%之間［11］，如Hi對氨苄西林耐藥率北京地區為14.3%［12］，上海為13.6%［4］，杭州為14.2%［5］。SENTRY抗生素檢測項目研究中氨苄西林耐藥率亞太地區是16.2%，美國是31.5%，加拿大是27.0%，拉丁美洲是12.5%，歐洲是11.8%［13］。Tarnargo等［14］對古巴1990～2002年938株Hi的耐藥性研究顯示Hi對氨苄西林的耐藥呈上升趨勢，為40.7%～54.8%。

　　2.1.2  頭孢菌素類及其它β內酰胺類 

　　北京俞桑潔等［12］對2000～2004年臨床分離的521株Hi耐藥性監測結果顯示：該菌對阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲鬆和頭孢呋辛非常敏感，對頭孢克洛不敏感率由2%增加到14.3%；上海張泓等［4］對2000～2002年分離的Hi藥敏檢測顯示：該菌對頭孢唑林、頭孢克洛和頭孢噻肟的耐藥率分別為16.1%、7.7%和4.0%；杭州華春珍等［5］對233株Hi藥敏試驗顯示：該菌對頭孢克洛、頭孢噻肟、頭孢曲鬆、亞胺培南的敏感率分別高達98.7%、99.6%、99.6%、99.6%，所有菌株均對阿莫西林/克拉維酸敏感。

　　2.2  Hi對大環內酯類、四環素類、喹諾酮類等抗生素的耐藥性
       
　　北京地區Hi對四環素、磺胺甲基異口惡唑甲氧苄啶、氯黴素的敏感性分別在55%～79%、22.9%～46.1%、82.4%～93.3%［12］；上海地區Hi對環丙沙星、複方新諾明、氯黴素和阿奇黴素的耐藥率分別為0.9%、59.6%、5.9%和0.8%［4］；杭州地區Hi對利福平、克拉黴素和氯黴素的敏感率分別為98.7%、91.0%、90.6%，對氧氟沙星敏感，對甲氧苄啶磺胺甲基異口惡唑的耐藥率最高達45.9%［5］。
    　　
　　在國外，SENTRY抗生素檢測項目［13］研究顯示，Hi對氯黴素、四環素、複方新諾明耐藥率美國分別為0.4%、0.7%、14.6%；拉丁美洲分別為1.7%、1.5%、30.8%；歐洲分別為1.6%、2.6%、17.8%；亞太地區分別為2.6%、2.6%、13.9%。在古巴Hi對常用抗生素的耐藥率較高，1999～2002年期間耐藥呈上升趨勢，對氯黴素、四環素、複方新諾明耐藥率分別為40.1%～51.6%、23%～45.2%、45.4%～58.1%［14］。

　　3  流感嗜血杆菌的耐藥機製
    　　
　　Hi對抗生素的耐藥機製可分6個方麵：第一類為產酶機製即菌株產生質粒介導的β內酰胺酶；第二類為不產酶機製，由青黴素結合蛋白（PBPs）改變和外膜蛋白（OMP）通透性下降引起的耐藥；第三類為氯黴素乙酰轉移酶的產生和外膜滲透性的降低；第四類為獲得外源性DNA編碼產生四環素耐藥或產生具有核蛋白保護作用的蛋白質；第五類為二氫還原酶的產生；第六類為編碼DNA解旋酶和拓撲異構酶IV上的A亞單位的gyrA和parC基因的變異。

　　3.1  Hi對氨苄西林的耐藥機製
    　　
　　Hi對氨苄西林耐藥的主要機製是菌株產生質粒介導的β內酰胺酶，PBPs改變和OMP通透性下降引起的耐藥較為少見［15］。

　　3.1.1  Hi的產酶耐藥機製 

　　Hi產生的β內酰胺酶主要是由質粒介導的TEM1型酶，其次為ROB1型酶。對於編碼TEM1酶的耐藥基因主要位於質粒pBR322上或轉座子A上，而編碼ROB1酶的耐藥基因位於4.4 kb的pROB質粒上。有關研究發現Hi耐氨苄西林的機製，尤其是b型菌株，90%產生TEM1酶，隻有8%產生ROB1酶，沒有同時產生兩種酶的菌株存在。在近幾年的研究中，對頭孢克洛耐藥的產酶菌株中ROB1占66.7%，TEM1占33.3%，並且研究中ROB1型Hi對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢克肟和亞胺培南的敏感性與TEM相似［16］。雖然ROB1底物構象與TEM1非常類似，但其pH值為8.1使它具有能夠更快速地水解氨苄西林和更慢地水解頭孢噻啶類抗生素，而且更易被鄰氯西林抑製的特點。

　　3.1.2  Hi的不產酶耐藥機製 

　　β內酰胺酶陰性的耐藥菌株（βlactamasenegative and ampicillinresistance, BLNAR）在1980年首次被報道，其耐藥機製主要是由於菌株細胞壁上一種或多種青黴素結合蛋白發生改變，引起青黴素結合蛋白與靶位親和力的降低，其次是由於外膜蛋白改變導致耐藥［17］。PBPs的本質是細菌細胞膜的膜蛋白，通過短鏈的羧基或氨基疏水性末端連接於細菌細胞膜的表麵，含量約占細胞膜幹重的1%，相對分子質量一般在（20～120）×103。PBPs作為參與細菌細胞壁肽聚糖生物合成的酶，有催化肽聚糖聚合（轉糖基作用）和交聯（轉肽作用）的活性及在肽聚糖生物合成的末端反應、形態維持和糖肽結構調整等方麵具有重要功能，因此它的結構功能是細菌保持正常形態及功能的必需條件。1981年第一次報道了氨苄西林敏感的Hi的PBPs，根據相對分子質量的大小，可將PBPs分為兩類：一類是低分子質量的PBPs，具有轉肽酶和（或）水解酶活性；另一類是高分子質量的PBPs，在某些細菌具有轉糖基酶活性。研究發現PBPs可分成1、2、3、4、5、6 等，同時根據不同基因編碼的相對分子質量情況，又將其分為多個亞種，如1a、1b、2a、2b等。Hi OMP通透性下降所致的耐藥性並非是由於任何染色體的突變或是耐藥質粒的獲得，往往是對抗菌藥物特異性較差，因此具有了多重耐藥性。Arbing等［18］用X線衍射晶體分析Hi OMP的結構，認為Hi對抗生素的耐藥性與特異性OMP P2的氨基酸序列的改變有關。此研究從電生理變化與抗生素敏感性關係角度出發，通過了對離子通道選擇性，電壓門控及單離子通道傳導等指標的檢測，來觀察OMP對MIC的影響，認為其中單離子通道傳導性的降低直接影響了Hi對抗生素的敏感性。

3.2  Hi對氯黴素、四環素、複方新諾明、氟喹諾酮的耐藥機製
    　　
　　Hi對氯黴素的耐藥多見於氯黴素乙酰轉移酶（CAT）的產生，而Jane等證實還與外膜滲透性的降低有關。對四環素的耐藥主要為獲得外源性DNA編碼產生四環素或產生具有核蛋白保護作用的蛋白質，也可能與前些年常用該藥有關。對複方新諾明的耐藥主要是由染色體介導的二氫葉酸還原酶的過量產生。Jone等［19］認為染色體編碼的floh基因突變引起對甲氧苄啶的耐藥性，對磺胺類的耐藥性是由染色體編碼在SulA類似物中的基因突變，而Enne等［20］認為，對磺胺類的耐藥機製有別於以前，在英國和肯尼亞Hi對磺胺類的耐藥主要是由於SU12基因介導和變型的flop基因介導。對氟喹諾酮的耐藥主要是編碼DNA解旋酶和拓撲異構酶IV上的A亞單位的gyrA和parC基因的變異［21］。

　　3.3  Hi多重耐藥產生的機製
    　　
　　目前，越來越多的研究發現多重耐藥Hi的存在，這是臨床治療中最棘手的問題。不同的耐藥基因可以整合在同一轉座子或質粒上進行傳播引起Hi多重耐藥，而β內酰胺酶中由染色體介導的廣譜β內酰胺酶也有可能引起多重耐藥。相關報道認為可能是Hi的一種接合性質粒可以同時編碼產生β內酰胺酶和乙酰轉移酶，從而決定了氨苄西林及氯黴素的雙重耐藥性。

4  結束語
    　　
　　抗生素的廣泛應用是細菌耐藥性形成和耐藥程度增加的重要原因，因此，合理慎用抗生素仍是減慢耐藥菌株快速增長的好方法。當Hi逐步地被我們認識的時候，深入了解其耐藥情況和耐藥機製對指導臨床用藥是非常有意義的。

作者：朱妍豔，華春珍，俞惠民

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