兩種檢測淋病奈瑟菌方法的比較

［摘要］ 目的：比較兩種檢測淋病奈瑟菌（NG）的方法。方法：采用熒光定量PCR檢測法和NG培養法。對155例臨床分泌物標本同時進行檢測。結果：熒光定量PCR檢測陽性率15.5%，培養方法陽性率4.5%.。兩者比較PCR方法陽性率顯著高於培養法（P<0.05）。結論：對NG的檢測，熒光定量PCR檢測法更適合，並且可有效減少假陰性。

　　［關鍵詞］ PCR；淋病奈瑟菌；淋球菌培養

　　淋病是國內外最常見的性傳播疾病之一,它嚴重影響著人們的身心健康,其病原體為淋病奈瑟氏菌(簡稱淋球菌，NG)。檢測淋球菌的方法有很多，最主要的現在是聚合酶鏈反應（簡稱PCR）和細菌培養法兩種。2005年下半年我們對155例門診疑似患者取樣進行了這兩種方式的比較，通過統計學處理認為FQPCR法提高了淋球菌檢測的準確性，也減少了淋球菌的漏檢率。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　標本來源與采集　　　　　　

　　標本來源於我院2005年9月至12月日常婦科門診和男性科門診及泌尿外科門診的155例疑似患者，年齡最大的59歲，最小的18歲，其中女性患者96例，男性患者59例。標本采集：男性用無菌拭子由前尿道2 cm~4 cm處取尿道分泌物，根據病情需要，也可取前列腺按摩液或精液。女性用女性拭子在宮頸管內1 cm~2 cm處取宮頸分泌物，在取宮頸標本時，應先用拭子將宮頸揩幹淨，再用另一個拭子取材。用拭子取材時，要在宮頸（或尿道）內旋轉並至少停留20 s以上，以便獲得較好的細胞。

　　1.1.2　儀器及試劑盒　　　　　　
　
　　熒光定量PCR儀為美國生產的ABI7000型，所用PCR試劑盒為深圳匹基生物工程股分有限公司生產；生物梅裏埃公司生產的API NH奈瑟氏菌及嗜血杆菌鑒定係統。

1.2　方法

　　1.2.1　熒光定量PCR法　　　　　　　

　　取100 μl待測樣本，加入100 μl DNA提取液1，振蕩混勻。13 000 r/min離心15 min，吸棄上清（離心時注意離心管方向，盡可能吸棄上清且不碰沉澱）。加入50 μl DNA提取液2，振蕩混勻。100 ℃幹浴10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清待用（如標本裂解產物當天不使用，則保存於-20 ℃。按試劑盒配製試劑，加入處理好的標本上機進行PCR擴增。循環條件設置：37 ℃：5 min;94 ℃:1 min;95 ℃:5 s,60 ℃:30 s,40個循環。反應體係設為40 μl。

　　1.2.2　NG菌培養　　　　　　　

　　采用淋球菌巧克力培養基，按試劑盒操作要求將拭子進行接種，在5%CO2溫箱35 ℃培養48 h~72 h。挑取可疑菌落進行革蘭染色，如鏡檢可見革蘭陰性腎形雙球菌，則進行API NH奈瑟菌鑒定係統鑒定。該係統利用標準化及微量化試驗並擁有與之相適應的數據庫。API NH試驗條有10個微孔管，內有幹燥基質，可進行12項鑒定反應（酶反應或糖發酵），並能測青黴素酶。孵育時所發生的各種反應可通過自發或加入試劑後顏色改變測出。在35 ℃~37 ℃培養2 h後即可目視判讀。參照使用手冊的反應模式表即可得到結果。

　　1.3　統計學處理　　　　　　
　
　　對155例疑似患者所進行的熒光定量PCR法和細菌培養法檢出率的比較分別用χ2檢驗。

　　2　結果

　　見表1。表1　兩種方法檢出結果（略）

　　3　討論

NG是常見的性傳播性疾病病原體，主要通過性接觸直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛門直腸黏膜，或在分娩時通過產道感染新生兒，臨床表現為：單純性淋病，臨床症狀為尿頻、尿急、尿痛，尿道口膿性分泌物；子宮頸紅腫、陰道分泌物增多和排尿困難；盆腔炎，表現為子宮內膜、輸卵管、盆腔的淋菌性炎症；口咽部和肛門直腸病；淋菌性結膜炎，發生於新生兒產道感染，眼部大量膿性分泌物，治療不及時可致盲；播散性淋病表現為畏寒、發熱、皮膚損害和關節炎症，少量患者可致化膿性關節炎和腦膜炎。培養法檢測NG，用於分離培養的標本直接接種於營養培養基中，立即置於5%CO2氣體條件下35 ℃~37 ℃孵育48 h~72 h，再進行鑒定。雖然培養法的特異性和準確性都非常高，但由於標本取材不理想及標本中混有其他雜菌及NG離體後易死亡等因素均可能影響該菌的陽性檢出率。漏檢率因此也相當高，且不易作出早期診斷，臨床醫生不歡迎使用該法。熒光定量PCR法檢測NG屬一種基因診斷技術，它借助於一種DNA擴增技術，能將含微量的淋球菌標本處理擴增。自2002年1月衛生部下發了有關基因擴增檢驗技術臨床應用的法規性文件《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發［2002］10號）和衛生部臨床檢驗中心配發的《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規範》（衛檢字［2002］8號）以來，對臨床PCR實驗室進行了規範化管理和驗收。在日常工作中嚴格執行質量保證體係中各種標準操作程序每次實驗均做陰陽性對照，檢驗結果準確可靠，基本上杜絕了假陰性及假陽性的產生。本實驗室通過NGPCR法和細菌培養法對155例門診疑似患者同時進行熒光定量檢測，並進行統計學處理得出了PCR方法陽性率顯著高於培養法（P<0.05）。並且PCR方法檢測時間短為臨床醫生所廣泛接受。唯一的缺點是做不了該菌的藥物敏感試驗。

作者：黃明 

　　參考文獻：

　　［1］Pierce KE,Rice JE,Sanchez JA,et al.L.Real time PCR using molecular beacons for accurate detection of the Y chromosome in single human blastomeres［J］.Mol Hum Reprod,2000,6(12).

　　［2］朱曉亮，曾抗.女性宮頸淋球菌3種檢測方法比較［J］.臨床皮膚科雜誌，2004，33(3):171172.

上一篇：血液中腦膜炎奈瑟菌的分離鑒定藥敏試驗及臨床分析

下一篇：20株非常見福氏誌賀氏菌菌型鑒定及耐藥性分析