肺炎鏈球菌幾種保存方法的比較

肺炎鏈球菌是醫學微生物實驗教學中經常要用到的菌種，該菌營養要求較高且能產生自溶酶，比一般細菌難保存，常用的定期移植保存法保存效果不理想。冷凍真空幹燥法雖能保存菌種數年或十年以上，但所需設備昂貴，操作複雜，一般實驗室難以配備。為能建立一種操作簡便、保存時間較長、勿需特殊設備的肺炎鏈球菌保存方法，我們就5種簡便易行的保存方法進行對比觀察，現報告如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  菌株  肺炎鏈球菌CMCC（B）31003。

　　1.1.2  脫脂牛奶  新鮮牛奶經反複脫脂數次後，0.07MPa高壓蒸汽滅菌15min後冰箱保存備用。

　　1.1.3  脫纖維羊血  用無菌手續抽取羊頸靜脈血，注入已滅菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，脫去纖維後分裝於無菌小試管中備用。

　　1.1.4  動物  健康昆明種小鼠。

　　1.1.5  菌種保存管  2ml安瓿或1.5ml連蓋塑料離心管，高壓滅菌後烘幹。

　　2  方法

　　2.1  甘油保存法  從生長良好的血平板上取2～3環肺炎球菌移入盛有0.5ml無菌甘油的小離心管中，蓋上蓋後用封口膜密封管口，放-20℃冰箱保存。

　　2.2  50%甘油肉湯保存法  無菌甘油與肺炎鏈球菌血清肉湯培養物以1：1比例混勻後取適量分裝於小離心管中，於-20℃下保存。

　　2.3  脫脂牛奶保存法  用準備好的脫脂牛奶洗下菌苔，用毛細滴管吸取菌懸液向安瓿內滴入幾滴，火焰封口後於-20℃下保存。

　2.4  脫纖維血保存法  用新鮮脫纖維羊血洗下菌苔，用滴管向安瓿內滴入幾滴菌懸液，火焰封口後於冰箱冷凍室中保存。

　　2.5  含菌鼠肝保存法  小鼠腹腔注射0.5ml肺炎鏈球菌菌液24h後處死小鼠，在無菌操作條件下打開腹腔，剪取幾小塊肝組織放入小離心管中，封好口後於-20℃下保存。

　　3  結果

　　每種上述方法保存若幹管，每個月取出一管室溫自然融化後取樣培養檢測菌株存活情況及主要性狀。幾種保存方法對肺炎鏈球菌的保存時間見表1。以含菌鼠肝保存法肺炎鏈球菌存活時間最長，可達18個月左右，其餘4種保存法菌存活時間不到1年。可見肝組織對菌的保護作用要優於甘油、脫脂牛奶等保護劑。

　　表1  幾種保存方法保存肺炎球菌的時間（略）

　　3  討論

    已報告的肺炎鏈球菌菌種保存方法有多種，基本上分為定期移植保存法、使用保護液凍存法和冷凍真空幹燥法三類。冷凍真空幹燥法是迄今最佳的菌種保存方法［1］，但所需專用儀器一般實驗室難以配備。保護劑常用的有甘油、脫脂牛奶、脫纖維羊血等［2］，但用保護液冷凍保存肺炎球菌一般隻能保存數月。肺炎球菌難以保存較長時間可能與該菌產生自溶酶有關。我室一直沿用血平板或血斜麵培養物保存此菌。雖然條件不高，但移種頻繁，須每半個月移種1次。操作包括羊血采集、培養基製作、接種及培養、舊菌種管的滅菌處理等，消耗較多的人力物力，而且頻繁的傳代接種容易導致雜菌汙染及菌種變異。我們通過對5種簡便易操作的保存方法效果的比較，發現采用含菌鼠肝塊可將肺炎球菌保存1年以上，可大大減少傳代次數，比較實用方便，且至今國內外尚未見報道，值得推廣。

　　【參考文獻】

　　1  張卓然. 醫學微生物學.北京：科學出版社，1998，226.

　　2  藍鴻泰.微生物學和微生物學檢驗.北京：人民衛生出版社，1988，123.

作者：王丹敏，吳勝吉，吳玉秀，董小青  中華醫學研究雜誌 2006年1月 第6卷 第1期

作者單位：300162 天津，武警醫學院微生物教研室

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