銅綠假單胞菌外毒素A的抗原性及其與輔助細胞的關係

【 摘要 】　目的　研究銅綠假單胞菌外毒素A（PE)的某些抗原性及其與輔助細胞的關係。 方法　用MTT法觀察PE在有無輔助細胞參與條件下對鼠脾淋巴細胞的刺激作用,並用鼠細胞毒性T細胞株CTLL進行證實。結果　PE在0.01～100ng/ml濃度範圍能刺激鼠脾淋巴細胞增殖，PE的絲裂原作用無需粘附細胞的輔助，但粘附細胞及其粘附細胞的PE刺激上清能協同PE對鼠脾淋巴細胞的刺激作用。PE在絲裂原作用範圍內能刺激CTLL細胞生長，並與IL-2有協同作用。PE在體內能使小鼠脾淋巴細胞自發淋轉率增高，對ConA刺激的增殖反應增強，但對淋巴細胞自發分泌IL-2和ConA誘導IL-2的產生水平無影響。結論　PE在無輔助細胞參與條件下也能刺激淋巴細胞增殖。

　　【 Abstract 】　Objective　Study on superantigen Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (PE) and its relationship with accessory cell (AC). Methods　PE-induced proliferation of murine splenocyte with or without accessory cells, cytotoxicity of murine cytolytic T cell line CTLL. Results　PE was found to be able to stimulate the proliferation of murine splenocyte in the absence of accessory cells. Accessory cell and its supernatant from AC stimulated with PE was able to enhance the proliferation of lymphocyte induced by PE. Meanwhile, PE also stimulated proliferation of murine CTL cell line CTLL and enhanced IL-2 effectiveness in CTLL proliferation. Antibody to PE could block this function. In vivo PE could enhance murine splenocyte proliferation but not level of IL-2 production. Conclusion　PE is a unique superantigen that stimulates murine splenocyte proliferation in the absence of acces-sory cells.

　　【 Subject words 】　Pseudomonas aeruginosa exotoxin A; Superantigen; Accessory cell; CTLL

　　銅綠假單胞菌外毒素A（PE)為條件致病菌銅綠假單胞菌分泌的一種相對分子質量(M_r)為66×10³的單鏈多肽，可分為三個結構功能區：Ⅰ區係氨基末端區，與靶細胞上2-巨球蛋白受體結合；Ⅱ區為跨膜區，與毒素“越膜就位”有關；Ⅲ區是羧基末端區，具有ADPR轉移酶活性，為毒素分子的活性部分，通過抑製蛋白質的合成而導致細胞死亡^〔1〕。在亞致死劑量，PE具有其它微生物抗原的性質^〔2-4〕，如：PE能誘導鼠胸腺細胞轉化，其刺激作用需要輔助細胞的處理及提呈等。我們在研究PE對鼠脾淋巴細胞的抗原作用時，發現PE在無輔助細胞參與的情況下也能刺激淋巴細胞增殖，現報告如下：

　　材料與方法

　　動物和細胞株：純係BALB/c雄性小鼠，8～12周齡，購自本院動物中心，IL-2依賴株CTLL，引自本院六所；小鼠成纖維細胞L929，引自本所二室。

　　培養基和試劑：PE(Cal Biochemical Corporation Lot 072291)；ConA(Sigma)；MTT(Fluka)；RPMI 1640(GIBCO)；抗PE多克隆抗體(本室製備)。

　　淋巴細胞轉化試驗：斷頸處死小鼠，無菌取脾，製備脾細胞懸液(8×10⁶/ml)，取細胞懸液、PE、ConA等樣品各100μl，加入96孔板，37℃，5%CO₂培養箱孵育不同時間，用MTT法檢測，每組設3個複孔。

　　脾細胞懸液中粘附細胞的去除：調整BALB/c 小鼠脾細胞濃度為4×10⁶/ml，置大空斑瓶(底麵積5×8cm²)中培養2h，使粘附細胞貼壁，收集未貼壁細胞，即為脾非粘附細胞，通過姬姆薩染色觀察，粘附細胞的去除率在95%以上。

　　小鼠腹腔巨噬細胞（MΦ）的製備：將3ml培養液注入小鼠腹腔，輕揉腹部，吸出腹腔液體，用培養液洗滌細胞2次配成2×10⁶/ml，加到24孔平底培養板，1ml/孔，置37℃，CO₂孵箱培養2h，棄去未粘附細胞，粘附細胞即為小鼠腹腔巨噬細胞。

　　CTLL細胞增殖試驗：CTLL細胞株用含20%小牛血清、IL-2 200U/ml的RPMI 1640完全培養基傳代培養，將處於對數生長期的CTLL細胞用不含IL-2的完全培養基洗滌2次，取細胞懸液(10⁶/ml)及PE等樣品各100μl，加入96孔培養板中，置37℃，5%CO₂及飽和濕度下培養24～48h，用MTT法測定。設標準IL-2和完全培養基對照。

　　PE免疫小鼠：按本室常規進行。亞致死劑量PE腹腔注射3次，間隔7～10d。

　　結果

　　1.PE的抗原性：用台盼藍染料排除法計算不同濃度PE與脾細胞共同孵育不同時間細胞存活率，結果顯示：PE濃度大於或等於100ng/ml，表現出毒性作用，所以我們將PE的刺激劑量定在100ng/ml以內。

　　PE的絲裂原作用：PE在0～100ng/ml範圍設6個濃度組，與鼠脾細胞共同培育1、2、4、7d，測定淋轉值，結果表明：PE的淋轉刺激濃度在0.01～10ng/ml之間，最適濃度為0.01～1.0ng/ml。PE組培育24h，未觀察到淋轉現象，隨培養時間延長，吸光度A值逐漸升高，第4天A值最高。ConA刺激組24h即有淋轉現象，最高刺激指數在第2天就能觀察到。PE的淋轉刺激指數為ConA的1/2，刺激時間相對延長，可見，PE為弱絲裂原(圖1)。

　　　PE協同ConA對鼠脾細胞致有絲分裂作用：將ConA固定在2.5μg/ml，分別加入不同濃度的PE，與鼠脾細胞37℃孵育3～4d，作淋轉測定。結果顯示：PE在絲裂原作用最適濃度範圍對ConA的淋轉刺激有協同作用（圖2)。

　　PE的絲裂原作用與粘附細胞的關係：文獻報道，PE誘導胸腺細胞淋轉需要輔助細胞^〔3〕。我們試驗了PE刺激脾細胞淋轉與粘附細胞的關係，結果發現(圖3)：PE誘導去除粘附細胞後的脾細胞淋轉雖不如去除粘附細胞以前高，但仍能刺激淋轉，加入腹腔巨噬細胞（MΦ）後，刺激值又恢複到以前的水平。

　為了弄清是粘附細胞還是其產生的細胞因子協同PE誘導淋轉，我們將PE與小鼠腹腔MΦ共培育24h，取培育上清，加入脾非粘附細胞培育4d，結果表明(圖3)：PE與MΦ的培育上清能誘導脾非粘附細胞轉化。刺激值大於PE單獨刺激的值。雖然PE與粘附細胞共育上清中殘留一定量的PE，但淋轉刺激值較單獨PE刺激的值要高，則上清中存在某種細胞因子參與PE的刺激作用。

　　2.PE免疫小鼠脾細胞免疫功能的測定：為了了解PE在體內對細胞免疫的影響，我們用PE免疫小鼠3次後，無菌取脾製成細胞懸液，觀察在有或無ConA刺激下，脾淋巴細胞增殖反應和IL-2產生水平。表1顯示：PE免疫小鼠脾淋巴細胞自發淋轉A值高於正常小鼠對照組，而IL-2分泌水平兩組差異無顯著性。PE免疫小鼠脾細胞對ConA的增殖反應較正常小鼠對照組明顯增強，而對ConA誘導IL-2產生水平與對照組差異無顯著性。結果表明：PE的絲裂原作用可促進小鼠脾細胞增殖，對脾細胞分泌IL-2能力無影響。

表1　PE在體內對鼠脾淋巴細胞轉化及IL-2分泌水平的影響

　　Note:^*P＜0.01 vs control　　3.PE對CTLL細胞的作用：為了驗證PE的抗原作用在無輔助細胞參與的情況下也能進行，我們用鼠細胞毒性T細胞株CTLL進行了證實。

　　PE刺激CTLL細胞生長：以不同濃度PE與洗滌後的CTLL細胞共孵育24～48h，用MTT法觀察CTLL細胞生長情況時發現(圖4)：PE能刺激IL-2依賴株CTLL細胞生長，最佳刺激劑量範圍與淋轉相同，即0.01～1ng/ml，可見PE在無輔助細胞的參入下也能刺激淋巴細胞增殖。

　　PE協同IL-2刺激CTLL細胞生長：將IL-2濃度固定在50U/ml，加入不同濃度PE，與CTLL細胞共孵育24～48h，發現PE在較大範圍(0.001～10ng/ml)內對IL-2的刺激有協同作用，最佳刺激劑量為0.01～1.0ng/ml(圖4)。

　　我們采用2種方法使PE失活：①PE與抗PE血清37℃作用60min。②PE經70℃加熱處理30min。2種方法處理後，PE對細胞L929的毒性消失(傳代細胞L929是文獻報道對PE最敏感的細胞，能作為指示細胞判斷PE的毒力)，處理後的PE對CTLL細胞的刺激作用消失，說明CTLL細胞的增殖由PE引起(圖4)。

　　討論

　　銅綠假單胞菌外毒素A具有雙向免疫調節作用，可誘導鼠胸腺細胞增殖分化^〔4〕，PE對鼠胸腺細胞的抗原作用需要輔助細胞的處理和提呈^〔2〕，為了了解PE對細胞免疫的影響，我們觀察了PE在體內外對鼠脾淋巴細胞的作用。鑒於PE對許多哺乳動物細胞有毒性，所以在實驗前，首先用台盼藍試驗確定了PE對鼠脾細胞的毒性劑量範圍。結果顯示：當PE劑量大於或等於100ng/ml時，對脾細胞顯示明顯毒性作用。以亞致死劑量PE與脾細胞共孵育時發現：PE對脾細胞有絲裂原作用，最佳刺激劑量為0.01～1ng/ml，刺激高峰時間為4d。與ConA相比，其所需劑量比ConA低1000倍，但刺激時間較長，淋轉刺激值比ConA低1倍以上。所以PE是弱絲裂原。我們在實驗中得出的PE最適劑量範圍較國外報道^〔5〕的劑量低100倍，可能是產品來源不同、純度不同或其它原因。進一步觀察PE的絲裂原作用與粘附細胞的關係時發現：在沒有粘附細胞參入下，PE也能刺激淋巴細胞增殖，不象國外報道^〔3〕的那樣需要粘附細胞的輔助。但國外報道的是PE刺激胸腺細胞淋轉需要粘附細胞輔助，可能胸腺細胞與脾細胞的表麵受體和分子有所不同或其轉化機製不同所致。此外，我們發現：分別加入鼠腹腔巨噬細胞、PE刺激腹腔巨噬細胞培養上清能提高PE對脾非粘附細胞的轉化作用，這與國外報道PE刺激的粘附細胞上清能取代粘附細胞導致胸腺細胞淋轉的結果有相似之處^〔4〕。這些結果說明：上清中存在的某種細胞因子可刺激淋巴細胞轉化，而不是由輔助細胞處理PE再呈遞給淋巴細胞而使後者轉化。推測PE對脾細胞絲裂原作用的可能機製是：PE對脾細胞中的淋巴細胞和粘附細胞均有作用，脾淋巴細胞直接受毒素結構上某表位的刺激而導致轉化，粘附細胞則吞噬、處理PE，釋放出PE片段或(和)某種細胞因子，再進一步促進淋巴細胞轉化，在PE對脾淋巴細胞轉化中，粘附細胞（吞噬細胞）起到協同、輔助的作用。

　　為了探討PE淋轉的直接誘發機理，我們將PE與鼠細胞毒性T細胞株CTLL（IL-2依賴株）共孵育24～48h，發現PE在0.01～1ng/ml劑量範圍能刺激CTLL細胞生長，並與IL-2有協同作用。CTLL細胞為傳代細胞，不含有粘附細胞，PE能使CTLL細胞增殖，必然也能直接作用於脾細胞而無需依賴粘附細胞的輔助。PE加熱70℃處理和抗PE血清中和後失去對CTLL細胞的刺激作用，PE究竟與細胞上哪部分結合，通過何種途徑刺激淋巴細胞增殖將是我們今後要研究的課題。國內外目前還未見此方麵的研究報道。

　　我們觀察到：PE在體內能增強脾細胞的自發轉化，但對脾細胞的IL-2分泌無影響，與國外報道PE在體外不能誘導脾細胞IL-2分泌的結果相似^〔6〕。實驗中觀察到：PE免疫的鼠脾細胞對ConA的反應增強，同時發現PE在體外與ConA也有協同作用，而國外報道PE在體外抑製PHA誘導的人外周血淋巴細胞轉化作用，兩者實驗結果相反，有可能是人與鼠的免疫應答不同，或ConA與PHA絲裂原作用機理、方式不同之故。

　　目前，對銅綠假單胞菌感染的防治是世界上迫切期望解決的問題，弄清PE的作用機製，包括PE對機體免疫功能的影響，將有助於人類最終攻克這一疾病。

作者：梁小兵 莊漢瀾 周潔 詹軼群 郭慶福

作者單位：軍事醫學科學院微生物流行病研究所

參考文獻

　　1，Allured YS, Collier R, Carrol SF, et al. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0-ngstrom resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:1320-1324.

　　2，Legaard PK, Legrand RD, Misfeldt ML. Lymphoproliferative activity of Pseudomonas exotoxin A is dependent on intracellular processing and is associated with the carboxyl-terminal portion. Infect Immun, 1992, 60(4)：1273-1278.

　　3，Legaard PK, Legrand RD, Misfeldt ML. The superantigen Pseudomonas exotoxin A requires additional functions from accessory cells for T lymphocyte proliferation. Cell Immunol, 1991, 135:372-382.

　　4，Misfeldt ML, Legaard PK, Howell SE, et al.Induction of interleukin-1 from murine peritoneal macrophages by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun, 1990, 58(4):978-982.

　　5，White JA, Herman AM, Pullen RK, et al. The V_β-specific superantigen Staphylococcal entertoxin B: Stimulation of mature T cell and clonal deletion in neonatal mice. Cell, 1989, 56:27-35.

　　6，Willner TZ. Induction of murine cytolytic T lymphocytes by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun, 1988, 56:213-218.

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