大腸杆菌核心型血清學檢測方法的建立

【 摘要 】　目的　製備大腸杆菌（E.coli）核心型單一特異性抗血清，建立E.coli核心型血清學檢測法，檢測致瀉性E.coli核心型。方法　ELISA間接法，用吸收後單一核心型特異性抗血清檢測鑒定E.coli核心型。結果　(1) 吸收後獲得單一核心型特異性抗血清，對E.coli核心型的檢測結果與相應單克隆抗體檢測結果完全相同；(2) 經鑒定表明，吸收後單一核心型特異性抗血清識別結合的抗原成分既非E.coli核酸和蛋白，又非E.coli類脂A和內核心KDO-庚糖，而是構成E.coli核心型的外核心己糖物質；(3) 四類27株不同血清型致瀉性E.coli核心型檢測結果為：R1核心型15株(55.5%)、R3核心型10株(37.1%)，K12核心型2株(7.4%)，未檢測出R2和R4核心型。結論　吸收後E.coli核心型抗血清具有較高單一核心型特異性，可用於E.coli核心型的檢測。

　　【 Abstract 】　Objective　To prepare the core type monospecific antisera of Escherichia coli (E.coli). To establish serological detecting method for core types of E.coli. To detect the distribution of lipopolysacchride core types in pathogenic E.coli.Methods　ELISA indirect method, we detected lipopolysacchride core types of E.coli using absorbed lipopolysacchride core type monospecific antisera in E.coli.Results　(1) The respective core type antisera were made as a monospecific one by repeated absorption. Lipopolysacchride core types of E.coli by absorbed lipopolysacchride core type monospecific antisera is same as that by the monoclone antibody; (2) The results proved that the components being recognized and bound by absorbed core type monospecific antisera was neither nuclei acid and protein nor lipopolysaccharide lipid A and inner-core KDO-heptopyranose, an but outer core hexose antigen composing E.coli lipopolysaccharide core types; (3) Lipopolysaccharide core types of 27 strains of different serotype pathogenic E.coli from 4 classes had been detected. The results showed: 15 strains (55.5%) expressed R1 core type, and 10 (37.1%) and 2 (7.4%) strains expressed R3 and K12 core types respectively. None of the 27 strains of E.coli expressed R2 and R4 core type.Conclusion　The respective core type antisera were made higher monospecific by repeated absorption, and it can be used in detecting E.coli lipopolysaccharide core types.

　　【 Subject words 】　Pathogenic Escherichia coli; Core type specific antisera

　　細菌脂多糖是革蘭陰性菌致病的主要物質，通常由暴露於菌體表麵的O特異性多糖和與之相連的核心多糖及類脂A三部分組成。O特異性多糖由重複寡糖單位構成，是決定細菌種和血清型的物質基礎。核心多糖分為內核心和外核心兩部分,前者與類脂A相連，其組成與構型相對恒定，是E.coli所共有的成分，簡稱KDO-庚糖區^〔1〕，後者與O特異性多糖相連，其單糖組成與構型有所差異，是決定E.coli核心型的物質基礎，又稱己糖區^〔2〕。用化學分析方法檢測發現，在E.coli脂多糖外核心中存在5種不同的寡糖分子結構^〔3〕，分別組成R1、R2、R3、R4和K12核心型，每株E.coli隻含其中一種。動物試驗表明，核心型特異性抗血清對同核心型E.coli感染具有良好的免疫保護和治療作用^〔4〕。Ziegler等人^〔5〕用這種核心型特異性抗血清治療E.coli感染性休克病人已初步獲得成功。但在抗血清使用前，必須對臨床分離的E.coli進行核心型的檢測和鑒定。E.coli核心型特異性單克隆抗體對相應核心型具有高度特異性，可用於E.coli核心型的檢測^〔6〕，但由於單克隆抗體製備複雜，難以推廣使用。為此我們建立了E.coli核心型血清學檢測法，並用該法對四類27株不同血清型致瀉性E.coli的核心型進行了檢測。

　　材料和方法

　　實驗動物：雄性家兔，體重2kg，由首都醫科大學動物室提供。

　　菌株：(1) 粗糙型(R) E.coli突變株：F470(R1)、F576(R2)、F653(R3)、F2513(R4)、W3100(K12)和臨床分離的經E.coli核心型單克隆抗體鑒定的光滑型(S) E.coli-106(R1)、E.coli-606(R2)、E.coli-922(R3)、E.coli-500(R4)、E.coli-1067(K12)，獲自BJ.Appelmelk博士(Free University, Netherland)。(2) 27株不同血清型致瀉性E.coli標準株，購自中國醫學細菌保藏管理中心。

　　單克隆抗體、抗血清和酶標抗體：(1) E.coli核心型單克隆抗體和E.coli內核心KDO單克隆抗體，獲自BJ.Appelmelk博士。(2) 辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG均購自軍事醫學科學院。

　　酶類和其它試劑：(1) 蛋白酶K、DNA酶、RNA酶和高碘酸購自華美生物工程公司。(2) 重組殺菌/滲透增強蛋白(recombinant bactericidal permeability increasing protein，rBPI₂₃)，獲自BJ.Appelmelk博士。

　　免疫原、吸收菌和包被抗原的製備：分別取粗糙型(R) E.coli突變株（核心型分別為R1～R4和K12），光滑型(S) E.coli（核心型分別為R1～R4和K12），27株不同血清型致瀉性E.coli的肉湯培養物，離心(4?000r/min，20?min)洗滌後，配製細菌懸液10¹⁰CFU/ml。從5種R型E.coli突變株菌液中各取20ml，100℃加熱30?min後-20℃保存，用作免疫原和對抗血清進行免疫吸收的抗原。從上述製備的R型、S型、致瀉性E.coli菌液中各取20ml，置高壓滅菌器內121℃加熱30?min後-20℃保存，作為ELISA試驗中的包被抗原。

　　核酸酶、蛋白酶K和高碘酸對包被抗原製劑的處理：(1) 取0.5ml包被抗原製劑(2.5×10⁹CFU/ml)與10μg(10μl)DNA酶和5μg(10μl)RNA酶混勻，37℃水浴30?min後加入250μg(50μl)蛋白酶K混勻，37℃水浴90?min，100℃加熱10?min將酶滅活，4℃保存。(2) 取0.5ml包被抗原(2.5×10⁹ CFU/ml)加入2.5mmol/L高碘酸(50μl)混勻，室溫轉鼓作用2?h，加4滴甘油混勻，室溫作用30?min後，4℃保存。

　　單一核心型特異性抗血清的製備：用粗糙型E.coli製備免疫原免疫家兔獲得相應E.coli核心型抗血清。每種核心型抗血清經其它不同核心型E.coli抗原反複吸收後^〔7〕，獲得單一核心型特異性抗血清。分別用粗糙型E.coli突變株抗原和光滑型E.coli抗原包被聚苯乙烯板，然後按ELISA間接法分別加吸收前、後核心型抗血清進行檢測，並用核心型單克隆抗體進行核實驗證。

　　酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：E.coli核心型檢測采用ELISA間接法，在96孔聚苯乙烯板上進行。包被抗原的濃度為10⁹CFU/ml，單克隆抗體濃度為1mg/L；吸收後抗血清稀釋度為1∶100，酶標記抗體稀釋度為1∶100。曾用單抗證實P/N比值＞2均為陽性，故實驗中規定P/N比值＞2為陽性，在表中陽性用“+”表示，陰性用“-”表示。

　　核心型特異性抗血清對E.coli核心型抗原識別的鑒定：(1) S型E.coli-106(R1)經DNA/RNA酶、蛋白酶K和高碘酸分別處理後進行測試^〔8〕，比較處理前後的檢測結果。(2) 用E.coli內核心KDO單克隆抗體和rBPI₂₃封閉S型E.coli-106(R1)脂多糖內核心KDO-庚糖和類脂A後進行測試^〔8〕，比較封閉前後的檢測結果。

　　結果

　　1.抗血清吸收前後與E.coli核心型抗原特異性結合的檢測結果：吸收前抗血清與R型和S型E.coli抗原有廣泛的交叉反應。吸收後交叉反應顯著降低，每種抗血清與相應E.coli核心型抗原反應的吸光度（A）值，至少比此種抗血清與其它幾種E.coli核心型抗原反應的A值大3倍。用相應核心型特異性單克隆抗體核實驗證，其核心型檢測結果與吸收後抗血清的檢測結果相符，表明吸收後抗血清具有單一核心型特異性抗血清，可用於E.coli核心型的檢測。見表1。

　　2.吸收後核心型特異性抗血清對E.coli核心型抗原識別鑒定的結果

　　（1）用DNA/RNA酶和蛋白酶K處理S型E.coli-106(R1)抗原破壞核酸、蛋白後，按已建立的ELISA方法測試，結果如圖1所示。處理前後S型E.coli抗原與吸收後核心型特異性抗血清反應的A值大致相同。表明吸收後核心型特異性抗血清識別結合的抗原成分不是核酸和蛋白。

　　（2）用高碘酸處理S型E.coli-106(R1)抗原破壞多糖成分後，按已建立的ELISA方法測試，結果顯示高碘酸處理後E.coli抗原與相應吸收後核心型特異性抗血清的反應性極大降低，其A值與其它幾種核心型特異性抗血清與該抗原反應的A值相似，表明吸收後核心型特異性抗血清識別結合的成分為脂多糖中的多糖物質。

表1　抗血清吸收前後與粗糙型(R)和光滑型(S)大腸杆菌抗原的反應

　　　（3）用E.coli內核心KDO單克隆抗體和rBPI₂₃封閉S型E.coli-106(R1)脂多糖內核心KDO-庚糖和類脂A後，按已建立的ELISA方法測試，結果顯示吸收後核心型特異性抗血清與封閉前後E.coli抗原反應的A值大致相同，表明核心型特異性抗血清識別結合的抗原成分既非脂多糖內核心KDO-庚糖、又非類脂A。

　　3.致瀉性E.coli核心型抗原的測定結果：8株不同血清型腸產毒性E.coli核心型均為R1核心型；7株不同血清型腸侵襲性E.coli核心型分布為R1核心型4株、R3核心型2株、K12核心型1株；11株不同血清型腸致病性E.coli核心型分布為R1核心型2株、R3核心型8株、K12核心型1株；1株腸出血性E.coli核心型為R1核心型。

　　討論

　　E.coli核心型檢測對指導核心型特異性抗血清的臨床應用和對細菌核心型與細菌毒力、藥物敏感性及臨床致病特點之間關係的研究具有重要意義。為此，我們建立了E.coli核心型血清學檢測法。

　　首先用粗糙型(R)E.coli突變株抗原免疫家兔獲得相應核心型抗血清。每種E.coli核心型抗血清經其它幾種核心型吸收菌反複吸收後，獲得單一核心型抗原特異性(表1)。為證實吸收後核心型特異性抗血清識別結合的E.coli抗原確為脂多糖外核心己糖物質，我們用吸收後核心型特異性抗血清對核酸酶、蛋白酶K和高碘酸處理前後的S型E.coli抗原進行了檢測。結果表明，吸收後核心型特異性抗血清識別結合的成分不是核酸和蛋白質抗原，確為多糖物質。用rBPI和E.coli內核心KDO單克隆抗體所作的封閉試驗證實，吸收後特異性抗血清識別結合的抗原既非脂多糖類脂A，又非內核心KDO-庚糖。上述實驗結果可以確定，吸收後核心型特異性抗血清識別結合的成分應是構成E.coli核心型的外核心己糖抗原。

　　用吸收後核心型特異性抗血清建立的ELISA法對四類27株不同血清型致瀉性E.coli的核心型進行了檢測。在四類27株不同血清型致瀉性E.coli中R1核心型15株(55.5%)、R3核心型10株(37.1%)、K12核心型2株(7.4%)，未檢出R2和R4核心型，這種檢測結果與BJ.Appelmelk等報道^〔8〕的菌血症患者血液中分離的E.coli核心型的檢測結果(R1核心型68%、R2核心型6.5%、R3核心型8.7%、R4核心型5.1%、K12核心型2.2%)存在明顯差異。這種差異在E.coli核心型與其致病性之間可能存在某種相關關係，有待深入研究闡明。

作者：柯岩　周燕竹　沈海中　黃恕　陳海倫　安雲慶

作者單位：柯岩 沈海中 陳海倫安雲慶(首都醫科大學微生物學和免疫學教研室)；周燕竹(北京同仁醫院)；黃恕(北京針灸骨傷學院微生物學教研室)

　　參考文獻

　　1，Luderitz O. Current topics in membrances transport. Academic Press, New York. 1982, P17-29.

　　2，Rietschel ET, Brade H. Bacterial endotoxins. Sci Am, 1992, 4:26-33.

　　3，Rietschel ET. Molecular structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Endotoxin research series. Vol.1, Amsterdam: Excepta Medica, 1990, P15-23.

　　4，Dunn DL, Ferguson RM. Immunotherapy of Gram-negative bacterial sepsis: enhanced survival in guinea pig model by use of rabbit antiserum to Escherichia coli J5. Surgery, 1982, 92:212-219.

　　5，Ziegler H. Treatment of Gram-negative bacteremia and shock with human antiserum to a mutant Escherichia coli. N Engl J Med, 1982, 302:1225-1230.

　　6，Gibb AP. Frequencies of lipopolysaccharide core types among clinical isolates of Escherichia coli defined with monoclonal antibodies. J Infect Dis, 1992, 166:1051-1057.

　　7，Baumgartner JD, O'Brien TX, Kirkland TN. Demonstration of cross-reaction antibodies to smooth Gram-negative bacteria in antiserum to Escherichia coli J5. J Infect Dis, 1987, 156:136-143.

　　8，Appelmelk BJ, An YQ. Frequencies of lipopolysaccharide core types in Escherichia coli strains from bacteremic patients. Microbiology, 1994, 140:1119-1124.

上一篇：致瀉性大腸杆菌中發現小腸結腸炎耶爾森菌毒力島

下一篇：銅綠假單胞菌外毒素A的抗原性及其與輔助細胞的關係