黃連素、溴化乙錠、十二烷基硫酸鈉對痢疾杆菌耐藥質粒的消除作用

 摘要　比較了黃連素二硫酸鹽(BDH)、溴化乙錠(EB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)不同濃度、不同處理時間和方式對痢疾杆菌耐藥質粒的消除作用。結果表明：BDH對痢疾杆菌耐藥質粒的消除作用較小；EB對痢疾杆菌的耐藥質粒有較好的消除作用，以連續培育法處理120h，消除率可達85%；SDS對痢疾杆菌的耐藥質粒有一定的消除作用，以高溫高濃度雙重處理交替培養，消除率可達27%。
　　細菌的耐藥性是治療細菌性疾病一個難題。我們在研究痢疾杆菌的耐藥性基因定位過程中，發現黃連素、溴化乙錠、十二烷基硫酸鈉對痢疾杆菌耐藥質粒均有不同程度的消除作用。現報告如下。
　　1　材料
　　1.1　菌株　20株多重耐藥性痢疾杆菌，每株菌轉代10管 ，共200管菌做質粒消除試驗。菌株來源及鑒定見文獻^〔1〕。
　　1.2　試劑　黃連素二硫酸鹽(BDH)、溴化乙錠(EB)、十二 烷基硫酸鈉(SDS)(均為進口分裝，購自華美公司)。
　　2　方法和結果
　　2.1　質粒消除試驗　采用連續培育法和高溫高濃度雙重 處理交替培養法。前者以Bouanchard法^〔3〕為基礎：將菌株接種於LB肉湯中，37℃ 振蕩培養6h。調整濃度至10^－5左右，取0.1ml接種於含一定濃度消除劑的LB肉湯 中，繼續振蕩培養。細菌呈輕微渾濁生長時，取出菌液稀釋至10^－5；取0.1ml轉種 於含同樣濃度消除劑的肉湯中，繼續振蕩培養6h。重複上述步驟，在選定的時間內(如24，4 8，120h)，少量快速提取質粒DNA，電泳檢查質粒消除情況。後一種方法是：將菌株接種於含一定濃度消除劑的LB肉湯中，41℃振蕩培養16h。取20μl菌液，接種於2ml LB肉湯管中， 41℃振蕩培養16h後；再取20μl菌液接種於含同樣濃度消除劑的LB肉湯管中，41℃培養16h ；取出50μl菌液接種於5ml LB肉湯管中，37℃培養16h。以堿裂解法快速提取質粒DNA，檢 測質粒消除情況。質粒未消除的，重複上述處理步驟(一個處理周期64h，兩個周期128h)。比較不同濃度、不同處理方式和時間BDH、EB、SDS對質粒的消除作用，篩選最佳的消除濃度 和方法。
　　2.2　質粒消除的檢測　以堿裂解法^〔2〕小量提 取質粒DNA，1%瓊脂糖電泳，EB染色，紫外投射儀檢測質粒消除情況。
　　2.3　結果　若以BDH、EB為消除劑，則連續培育法效果較 好，二者的處理濃度分別為100μg/ml和30μg/ml。若以SDS為消除劑，則以高溫、高濃度雙 重處理交替培養法效果較好，處理濃度為60μg/ml。三種試劑相比，EB對質粒的消除作用最 好，SDS次之，BDH最弱(見表1)。
　　　　表1　三種試劑對痢疾杆菌耐藥質粒的消除率(%)

　　*P＜0.01

3　討論
　　研究結果表明：EB對痢疾杆菌質粒的消除作用最好；以連續培育法，48h消除率可達20%，12 0h可達85%，隨著處理時間的延長消除率明顯提高。Rubin^〔4〕等報道，延長時間未能提高質粒的消除率。我們推測，這可能與他們的試驗方法有關。若細菌隻在含消除劑的肉湯裏轉種一次，在細菌數目不斷增多、而消除劑濃度保持不變的情況下，每個細菌平均所受消除劑的作用實際在下降；加之代謝產物不斷積累，營養成分不斷減少，即使延長時間，也難以提高消除率。Smith等^〔5〕報道若第一次消除試驗不能成功，可將試驗菌株在含有消除劑的肉湯裏轉種幾次。據此我們對Bouanchard法做了改進，使菌株在試驗過程中處於相對恒定的消除劑作用之下，並保證培養基中營養的豐富和pH值相對穩定，產生了較好的消除作用。試驗結果表明，黃連素對痢疾杆菌的耐藥質粒也有消除作用，但消除率較低，用連續培育法處理120h，消除率隻能達到8%。消除率未能隨著處理時間延長而提高。我們還摸索出高溫(41℃)、高濃度(60μg/ml，相當於0.006%)SDS雙重處理交替培養法，即先找出能容許細菌生長的SDS的最高培養濃度，在這個高濃度下高溫處理。在含高濃度SDS的LB肉湯中交替傳代，經反複驗證，效果良好，消除率可達27%。

作者：楊春梅; 馬治平; 王誌鵬; 楊儉;

作者單位：蘭州軍區衛生防疫大隊

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