摘 要 以黑暗鏈黴菌Streptomyce tenebrarius 163為出發菌株,應用磁場、磁場複合吖啶橙、耐受氨甲酰-妥布黴素、磁場複合耐受氨甲酰-妥布黴素篩選得到5株高產菌株,經搖瓶發酵複篩後表明,其總效價與氨甲酰-妥布黴素均比出發菌株提高了25%以上.
Abstract A tobramycin-producing strain,Strepomyces tenebrarius 163 was mutated by magnetic field,magnetic field combined with acriding and resisted by carbamoyltobramycin,carbamoyltobramycin combined with magnetic field.Several high-yielding mutants were screened out.After flask rescreening,it is indicated that these mutants′ potency and the percentage of carbamoyltobramycin increased by above 25% than those of the parent strain.
Key words carbamoyltobramycin;nebramycin factor 5′;Strepomyces tenebraruis;mutation
妥布黴素是美國禮萊公司1969年自一株黑暗鏈黴菌(Streptomyces tenebrarius)的發酵液中分離到的尼拉黴素(nebramycin)複合物中的組分6,美國最初報道黑暗鏈黴菌產生的尼拉黴素組分甚多,有1,1′,2,3,4,5,5′,6,7,8,9,10,11,12,13等15種組分.現在國內用於生產妥布黴素的菌株隻產生組分2(安普黴素)和組分5′(6″-0-氨甲酰-妥布黴素,CTB),妥布黴素是由6″-0-氨甲酰-妥布黴素經堿水解而得到的〔1〕.目前,美、英、日、中、匈等國家生產妥布黴素.
妥布黴素是世界上使用最廣泛的第二代氨基糖苷類抗生素之一.該品對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效,對吲哚陽性變形杆菌、克氏氣杆菌、假單孢菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌亦有很強抗菌活性,特別是對綠膿杆菌抗菌活性更強(比慶大黴素強2~4倍),且對慶大黴素耐藥的部分綠膿杆菌有效且毒性更低.硫酸妥布黴素(商品名Nebcin)用於治療呼吸道感染、皮膚、軟組織和骨、尿道和腹內感染、敗血症等的總有效率在85%以上〔2〕.妥布黴素亦可用於治療嚴重的G+、G-菌引起的混合感染,與羧苄青黴素合用抗綠膿杆菌有協同作用.妥布黴素對第八對腦神經的耳毒性比新黴素、慶大黴素等低得多.
妥布黴素為一白色粉末,堿性,有吸濕性,易溶於水,微溶於乙醇,不溶於乙酸乙酯和氯仿.妥布黴素在室溫及
國內妥布黴素產生菌產生二個組分2、5′,由於提取、精製的步驟複雜,成本較高,製約妥布黴素生產和應用,因此,篩選總效價及組分5′含量高的優良菌株對妥布黴素的生產無疑具有重要的意義.據文獻報道,磁場對微生物的生長繁殖有較大的影響,可以改變微生物的生長情況〔3〕;通過抗自身代謝產物可以提高抗生素的產量〔4〕.本實驗采取上述方法處理出發菌株,獲得產氨甲酰-妥布黴素組分5及總效價高的高產菌株.
1 材料與方法
1.1 菌種
出發菌株為黑暗鏈黴菌163(S.tenebrarius 163),總效價為3 900 μ/mL,氨甲酰-妥布黴素組分含量為45%;檢定菌株為枯草芽孢杆菌(B.subtilis1.339)和金黃色葡萄球菌,用於生物效價測定及薄層法生物顯影,確定組分.
1.2 培養基
斜麵及分離培養基:高氏1號合成培養基.
種子培養基:葡萄糖,蛋白腖,酵母膏,氯化鈉.
發酵培養基:葡萄糖,黃豆餅粉,花生餅粉,玉米澱粉,硫酸鎂,硫酸銨,碳酸鈣等.
1.3 誘變方法
吸取單孢子懸浮液0.8 mL於內徑為
將經過磁場誘變處理的孢子懸浮液稀釋塗布在含一定濃度的吖啶噔的分離培養基平板上,
將孢子懸浮液稀釋塗布在含有一定濃度的氨甲酰-妥布黴素的分離培養基平板上,
1.4 篩選
分離培養基平板上長好的菌落用牙簽點種於預先鋪好的分離培養基平板上,每個菌落點種2次,並做好編號.每次誘變處理至少要點種100個菌落.經點種的分離培養基平板於
將經點種的分離培養基平板上剛剛長好的菌落打塊,放在無菌空平皿上,編號,
將保濕培養得到的源於同一菌落的瓊脂塊分別放在混有枯草芽孢杆菌和金黃色葡萄球菌的檢定盤上,
將成熟母斜麵的菌株全部上搖瓶發酵,選取總效價及氨甲酰-妥布黴素組分含量高的菌株傳子斜麵,再進行搖瓶複篩.方法同上.
1.5 總效價測定
采用生物測定法.初篩用單劑量紙片法.複篩用二劑量管蝶法(參照中國藥典1995年版二部附錄).
1.6 組分測定
采用矽膠G薄層層析法測定發酵液中活性物質的組分.溶劑係統為丁酮∶乙醇∶氨水(1∶1∶1).展層完畢,取出,吹幹,扣在表麵鋪有定量濾紙的檢定盤上,30分鍾後取下,
2 實驗結果
2.1 磁場誘變處理
磁場已經在醫學、農業、環境保護和生物工程等方麵得到廣泛的應用,我室首先將其用於麥迪黴素、慶大黴素的研究中,均得到了高產菌株〔5〕.根據磁場誘變劑量與死亡率的關係的預實驗,確定7 000 GS磁場強度為誘變劑量,該劑量的菌種死亡率為78.9%,光禿型菌落出現頻率為13.6%.
2.2 磁場複合吖啶橙誘變處理
文獻報道〔6〕,在黑暗鏈黴菌的高產菌株篩選中,添加不影響微生物生長的氮蒽類染料,可以引起幾乎所有的菌株產生的複合物含量比例的改變.S.cremeus Var.tob菌株篩選的分離培養基中加入0.5~2 μg/mL吖啶橙,可使組分2(安普黴素)被抑製50%,而組分5′(氨甲酰-妥布黴素)可提高15%~20%.另外,王魯燕〔7〕在妥布黴素高產菌株篩選中使用了吖啶橙(0.5 μg/mL)取得了較好結果,因此本實驗決定用磁場複合吖啶橙進行誘變處理.
表1 分離平板中吖啶橙的劑量
對菌種S.tenebrarius 163生長的影響
吖啶橙劑量C/μg5mL-1 |
0.2 |
0.5 |
1.0 |
2.0 |
死亡率/% |
11.0 |
12.7 |
18.4 |
26.3 |
光禿型菌落出現頻率/% |
16.7 |
17.3 |
19.2 |
27.6 |
首先確定分離培養基中吖啶橙的劑量,結果(見表1)顯示,吖啶橙在0.2~1.0 μg/mL濃度之間菌種死亡率較低,且變化不大,對生長無明顯影響.當用上述濃度吖啶橙和磁場做複合處理時,菌種死亡率為87.6%~93.4%,而用2.0 μg/mL吖啶橙處理時,菌種死亡率高達99.6%以上,故選定分離培養基中吖啶橙的劑量為1.0 μg/mL與磁場複合處理菌種,結果見表
2.3
固體耐受氨甲酰-妥布黴素劑量的確定,見表3.
結果顯示,固體耐受氨甲酰-妥布黴素劑量增大,菌株生長速度減慢.如培養至第三天,可見耐受1000 μ/mL的分離平板上菌落長出,第四天耐受2000 μ/mL的菌落長出;到第六天和第八天才可見有極少數的菌落在耐受3000 μ/mL、4000 μ/mL的分離平板上長出.隨著耐受劑量的提高,菌株死亡率增大,光禿型菌株出現頻率增高,且菌株形態變異率高.故選擇固體耐受劑量為2 000μ/mL來處理S.tenebrarus 163,篩選結果見表2.
將磁場7 000GS處理16 h的單孢子懸浮液塗布在含有氨甲酰-妥布黴素1 500 μ/mL的分離平板上,菌種死亡率達95.0%,篩選結果見表2.
各種處理方法篩選結果見表2.
表2 各種處理方法得到的菌株篩選結果
菌株編號 |
總效價提高百分率/% |
CTB提高百分率/% |
菌株編號 |
總效價提高百分率/% |
CTB提高百分率/% |
MF*-030 |
32.8 |
14.8 |
MFAO-129 |
76.6 |
27.5 |
MF-006 |
41.4 |
15.5 |
RT***-032 |
2.3 |
26.6 |
MF-118 |
11.5 |
16.2 |
RT-009 |
18.6 |
19.4 |
MF-114 |
34.0 |
14.0 |
RT-024 |
-11.2 |
25.5 |
MF-241 |
15.5 |
15.8 |
RT-115 |
8.5 |
24.7 |
MFAO**-037 |
17.4 |
21.7 |
RT-105 |
33.7 |
25.1 |
MFAO-073 |
22.2 |
26.6 |
RT-223 |
3.8 |
32.4 |
MFAO-105 |
64.0 |
35.4 |
RT-224 |
14.5 |
20.3 |
MFAO-108 |
29.9 |
11.3 |
MFRT****-213 |
36.6 |
28.1 |
MFAO-128 |
66.5 |
-3.9 |
MFRT-216 |
33.6 |
38.2 |
*磁場誘變篩選得到的菌株;**磁場複合吖啶橙篩選得到的菌株;
***耐受氨甲酰-妥布黴素篩選得到的菌株;****磁場複合耐受氨甲酰-妥布黴素篩選得到的菌株表3 不同劑量氨甲酰-妥布黴素對S.tenebrarius 163的處理結果
劑量C/μ5mL-1 |
死亡率/% |
光禿型出現頻率/% |
500 |
21.7 |
11.3 |
1000 |
66.5 |
18.2 |
2000 |
91.7 |
25.4 |
3000 |
95.8 |
37.6 |
4000 |
99.9 |
55.1 |
3 討論
a.本實驗所用到的各種處理方法,從篩選結果看,應用磁場誘變處理菌種,總效價提高幅度要高於CTB提高的幅度;磁場複合吖啶橙處理菌種,總效價、CTB含量可再提高一步,得到MFAO-105、MFAO-129等較好的菌株,它們的總效價、CTB含量均提高了64.0%和27.5%;耐受自身產物處理菌種,CTB組分的提高幅度要大於效價提高幅度,CTB含量提高20%~30%,而總效價隻提高了10%~20%;當磁場和耐受自身產物複合處理時,兩種處理因子對高產菌株的篩選有協同作用,即總效價和CTB的含量均有較大幅度提高,如MFRT-213的總效價提高了36.6%,CTB含量提高了28.1%,MFRT-216總效價提高了33.6%,CTB組分含量提高了38.2%,用以上這種方法處理得到了比較滿意的高產菌株,其總效價可達6500 μ/mL以上,CTB組分含量可達80%以上.
b.本實驗固體篩選用到的金黃色葡萄球菌是經過誘變處理得到的具有耐受安普黴素、而對氨甲酰-妥布黴素敏感的菌株,該菌株最高可耐受4 000 μ/mL安普黴素而不產生抑菌圈,對妥布黴素敏感,在含1 000 μ/mL妥布黴素的平板上可產生直徑為15~
作者:張怡軒 白秀峰 何建勇 王明琳
作者單位:沈陽藥科大學製藥係
上一篇:完善細菌內毒素檢查法淺議
下一篇:影響臨床微生物檢驗質量因素的分析
相關文章: |