白念珠菌對氟康唑耐藥性的研究

摘　要　目的：探討白念珠菌對氟康唑耐藥性的產生是否有適應性突變的因素。方法：選擇對氟康唑敏感的白念珠菌野生Y0109株，將其在含8 μg/ml氟康唑的沙堡固體培養基上進行漂移試驗誘導培養，計數其生長出的菌落並根據Cairns的理論進行曲線擬合。結果和結論：擬合出的曲線基本符合Poisson曲線分布特點，根據Cairns的適應性突變理論及判定方法，初步證實白念珠菌對氟康唑耐藥主要是因藥物本身的後天誘導作用，使該敏感白念珠菌發生了適應性突變而成為耐藥菌株。

　　關鍵詞：念珠菌，白色　氟康唑　突變　藥物耐受性

　　目前，臨床致病菌的耐藥問題是人類所麵臨的醫學難題之一。近年來隨著真菌感染患者的增多及抗真菌藥物應用的頻繁，真菌耐藥現象也越來越普遍。最常見的致病真菌為白念珠菌，而白念珠菌耐氟康唑為最常見的真菌耐藥現象^［1］。在臨床治療同一艾滋病患者念珠菌性口炎時，所需氟康唑劑量需逐漸增大，菌的耐藥水平也逐漸增大，而菌株並沒有改變^［2］。對耐藥菌的出現，人們通常習慣認為是抗生素殺死了敏感菌，而將耐藥的菌群亞株選出來，即耐藥株是先天存在的，而非後天的適應性改變。較早涉及研究微生物是否有適應現象這個問題的是Luria和Delbrück；Cairns等^［3］在1988年通過大腸杆菌Lac^-株利用乳糖的漂移試驗，提出了適應性突變理論。本實驗就目前臨床最常見的真菌耐藥現象——白念珠菌對氟康唑耐藥性的來源作一初步研究。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　白念珠菌Y0109株，為標準敏感野生株，對氟康唑敏感，用NCCLS(the National Committee for Clinical Laboratory Standards)方法測得耐藥值小於0.5 μg/ml；白念珠菌Y0119株，為標準耐藥株，對氟康唑耐藥，用NCCLS方法測得耐藥值大於32.0 μg/ml；以上菌株均由中國醫學科學院皮膚病防治研究所提供。氟康唑粉劑由第二軍醫大學藥學院有機化學教研室提供，用生理鹽水溶解製成800 μg/ml母液備用。培養基選用不含任何藥物的沙堡液體培養基和沙堡固體培養基（即空白培養基），及含氟康唑8 μg/ml的沙堡固體培養基。

　　1.2　方法

　　1.2.1　原理　根據Cairns所述理論^［3］，如白念珠菌敏感株Y0109株在含藥培養皿上長出的耐藥株隻是其中先天就耐受氟康唑的亞株，則其在數個同樣培養皿中生長出的耐藥菌落數目應符合Delbrück曲線分布特點。 如在含藥平皿上長出的耐藥菌落全為後天適應性突變而產生耐藥的，則長出的菌落數目分布應符合Poisson曲線分布特點。如與先天遺傳及和後天適應性突變均有關，則為兩者複合圖形。

　　1.2.2　Y0109株氟康唑誘導培養及菌落計數　將Y0109株在空白固體沙堡培養基上培養24 h後，挑取1個單菌落（以保證菌為單克隆菌），用注射用水製成混懸液後，平均分至11個含10 ml液體沙堡培養基大試管中，培養48 h，檢測菌濃增殖到(2～3)×10⁷ cfu/ml時 ，用振蕩器將其振蕩15 min搖勻，每管塗10個平皿，每個平皿用0.5 ml（每個平皿中含10 ml固體沙堡培養基，含氟康唑濃度為8 μg/ml），第11號管為空白固體沙堡培養基對照。給每個平皿編號。每隔24 h計數所能觀察到的新生菌落數，共觀察10 d，直至沒有新生菌落產生。共塗布培養皿112個（包括第11隻管隻塗2個空白培養基作對照）。

　　1.2.3　各株菌在無藥情況下生成菌落的速度　將敏感菌株Y0109株、標準耐藥株Y0119株及誘導出的耐藥株分別在不同試驗室用無菌生理鹽水稀釋，連續振蕩15 min，製成均勻混懸液，菌量調至(2～3)×10⁴ cfu/ml，均用0.5 ml菌液塗布空白固體沙堡培養基上，每組10個平皿，各組取平均值。

　　1.2.4　各株菌在氟康唑固體沙堡培養基上菌落生成速度　除培養基由空白換成含氟康唑8 μg/ml外，餘材料及操作同上。

　　1.2.5　敏感菌株中先天耐藥菌數目檢測　用含菌4×10⁷ cfu/ml的Y0109株菌混懸液（製備方法同上）0.5 ml塗布到含氟康唑8 μg/ml固體沙堡培養基上，共10個平皿，觀察24 h。用臨床耐藥株Y0109株做如上操作作為對照（在不同實驗室）。

　　1.2.6　在含藥8 μg/ml固體沙堡培養基白念珠菌的活力保持　絕大多數白念珠菌不能發生突變而長不成菌落，但仍有活力。第10天時，在培養皿（注意保持濕度，在100個含藥誘導培養平皿中隨機選擇10個）沒有長出菌落的部位盲塗轉種到2個空白培養基上，並同時轉種1個含藥培養基（含氟康唑8μg/ml）作對照。

　　2　結　果

　　2.1　標準敏感株誘導培養後菌落數　在誘導培養過程中，空白對照平皿24 h後菌落就已密布平皿，含藥的平皿在72 h後才出現單個菌落。觀察7 d後才無新的可見菌落生成。在100個含藥平皿中，平均每個平皿長出的耐藥菌落數目為m=52.35（16～157）。以10 為組距，分組後統計各組的頻數，取各組上下限的均數計算頻數及相應均數的常用對數值，參照Cairns的理論圖形格式進行繪圖(圖1，曲線a)。

圖1　（略）　　根據Cairns理論，在m=52.35,n=100情況下，利用公式P(X)=e^-μμ^x/X！, P(X)其中為發生X次突變的理論頻數,e為自然底數，μ為總體均數(實際運算中以平均突變數m代替)，X！代表X的階乘，其推導出的Poisson曲線為曲線b。

　　根據Delbrück的自由突變理論及公式^2］推導出的圖形為曲線c。P_r為發生r次突變的概率，為應該發生j次突變而實際發生了r次突變的樣本數，m為實際發生突變的均數。

　　從圖1曲線a與b圖形形狀看，具有近似性；而與圖中 Delbrück曲線c圖形相差甚遠。由此可以推論:白念珠菌對氟康唑耐藥主要是因後天氟康唑誘導作用，即主要是因為白念珠菌對氟康唑的抑製作用發生了適應性突變所致。但曲線a仍有少許拖尾現象，即這個圖形是一個複合圖形，故考慮不排除先天耐藥成分，即自然突變導致耐藥成分的存在。

　　2.2　耐藥菌與敏感株菌在空白沙堡培養基菌落生成速度比較　各菌株觀察時間、計數見表1。

表1　各菌株菌落生成數目比較

　　Tab 1　Contrast the colonial number of

　　each fungus strain

　　以上數據經過如下修正：各數據除以相應的初始接種濃度，以校正因接種濃度不同所引起的誤差。結果經方差分析兩兩比較檢驗，證明無顯著差異，即各菌株生成菌落數目無差異；因觀察時間相同，故考慮各菌株菌落生成速度也無顯著差異（不包括敏感菌對照資料）。

　　2.3　敏感株中先天耐藥菌比例　將 4×10⁷ cfu/ml Y0109株菌0.5 ml接種到含氟康唑8 μg/ml固體沙堡培養基上，共10個平皿，觀察24 h，未見明顯菌落，在72 h後漸出現菌落。而用臨床耐藥菌Y0119株所做的10個對照平皿在12 h即有菌落出現，24 h後就密布平皿。

　　2.4　含藥平皿上敏感菌活力保持時間　在轉種的20個空白培養基中，經24 h後均長出菌落，而10個含藥對照平皿培養7 d後仍未見有菌落形成。

　　3　討　論

　　本實驗在標準敏感株誘導培養計數菌落過程中，隻發現有3個較大菌落，且出現在培養72 h後；沒有發現在早期同時出現多個菌落的組。用耐藥菌所做的對照顯示，耐藥菌在含藥平皿上與敏感菌在空白平皿上生成菌落的速度具有一致性，也產生大小類似的菌落；即使耐藥株經過了空白平皿的培養傳代，這一性質也不會改變。事實上，我們將誘導出的耐藥菌與敏感菌做這一對照試驗時也驗證了這一點。另外，如實驗所示用0.5 ml 10⁷ cfu/ml敏感菌菌量，在8 μg/ml平皿上培養24 h並無可見菌落出現，而用白念珠菌耐藥株Y0119株在含有相同濃度藥物的平皿上所做的對照，生長出的菌落在24 h內已經密布平皿，這說明在敏感株中因自然突變而導致的耐藥性是很低的。

　　如是在接觸藥物後發生的突變，即藥物誘導出來的突變，則由於誘導培養環境相似，則各培養皿長出的耐藥菌落在時間、大小、數目上應有近似性。正如圖1所示，圖形屬於Poisson 和Delbrück這兩種曲線的合並，但主要以Poisson圖形為主。也就是說，耐藥株的產生以後天誘導為主。這就從理論上初步驗證了誘導耐藥現象的存在，即耐藥的出現與菌對藥物的適應性突變有重要關係；白念珠菌在氟康唑的藥物作用下會發生適應性突變，導致耐藥。

　　根據所接種的菌量（約為1.2×10⁷ cfu）與平均產生的突變菌落數（約為50個），加之在固體平板上，且產生的菌落相距較遠，故可基本排除接觸藥物後會有“互飼”及耐藥基因的傳遞而影響實驗結果，即一個耐藥菌落就代表一個敏感菌（及其所長出而未脫落的芽）突變成耐藥菌。

　　在含藥的誘導培養基上，隻要是耐藥菌，藥物並不能影響其菌落形成速度；即先天耐藥菌不會因遲滯生長而與誘導出的耐藥菌相混同，也不會因生長遲緩而引起計數誤差。

　　氟康唑在沙堡培養基中濃度為8 μg/ml時隻是抑菌,即使是敏感菌也可在其上存活較長時間（大於10 d）；白念珠菌在被抑製的環境中發生了適應性突變。因此，測菌的MIC必須用標準統一的方案。

　　根據本實驗數據所繪製的曲線與Poisson曲線有差異，除不能排除自然突變因素外，還可能有以下因素：（1）計數菌落誤差，對個別較小菌落有漏計或重計；（2）接種量誤差，此有待統計學校正；（3）菌自然凋亡而不能生成菌落。

　　總之，本實驗可以為臨床醫生正確使用抗生素提供理論依據，從而確認所謂“小劑量預防用藥”是錯誤的，提示濫用抗生素是極其危險的——極有可能給人類帶來耐藥菌。

　　作者簡介：梁曉博，男，1967年7月生，博士生

　　作者單位：第二軍醫大學長征醫院皮膚科，上海，200003

　　參考文獻

　　1　廖萬清， 吳紹熙. 中國致病真菌流行病學動態研究.見：廖萬清 主編. 真菌病學研究進展［M］. 上海：第二軍醫大學出版社，1998.1～10

　　2　White TC. Increased RNA levels of ERG16, CDR and MDR1 correlate with increases in azole resistance in candida albicans isolates from a patients infected human immunodeficiency virus［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(7):1482

　　3　Cairns J, Overbaugh J, Meller S. The origin of mutants［J］. Nature ,1988,335(8): 142

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