奇異變形杆菌潛生體與繁殖體的耐藥性差異及其機製探討

摘　要　目的：觀察奇異變形杆菌潛生體與繁殖體的耐藥性差異並探討其發生機製。方法：采用一株自己構建的標準產酶菌株和一株臨床分離菌株，經波動培養法誘導產生潛生體及繁殖體，檢測二者的耐藥性差異，並通過β-內酰胺酶活性分析、外膜通透率測定及外膜蛋白SDS-PAGE檢測來探討其發生機製。結果：潛生體的耐藥程度普遍高於繁殖體，二者的β-內酰胺酶活性差異不顯著(P＞0.05)，潛生體外膜通透率降低且有多種外膜蛋白減少或缺失。結論：外膜蛋白的大麵積減少或缺失對潛生體耐藥程度的提高可能起著重要作用。

　　關鍵詞：奇異變形杆菌　潛生體　繁殖體　耐藥性

　　奇異變形杆菌在固體培養基上生長或感染組織時，形態上會出現纖細狀長條菌與短杆菌之間的交替變化^［1］，國外一般將其命名為Swarmmer細胞及Swimmer細胞，國內也有研究者依據Swarmmer細胞及Swimmer細胞的生物學特性，將它們分別命名為潛生體(Cryptic growth cells, CGC)及繁殖體(Vegetative cells, VC)^［2］。本研究采用了兩株不同的奇異變形杆菌標準菌株，在特定培養條件下誘導產生潛生體和繁殖體，對二者的耐藥性進行了比較，旨在初步探討這種耐藥性差異的存在與否及其發生機製。

　　1　材料與方法

　　1.1　主要藥品與試劑

　　青黴素G(PenicillinG, PCG)，氨苄西林(Ampicillin,AMP)，頭孢噻吩(Cephalothin, CPT)，頭孢孟多(Cefamandole,CMD)，四環素(Tetracycline,TC)，均由上海第三製藥廠生產。氯黴素(Chloramphenical,CP)，南京第一製藥廠產品。諾氟沙星(Norfloxacin,NFLX)，太原製藥廠產品。

　　丙烯酰胺，Serva產品。N，N′-亞甲雙丙烯酰胺，Fluka產品，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸胺均為E Merck產品。十二烷基硫酸鈉(SDS)，Sigma產品。中分子量標準蛋白質，中科院上海生化所產品。其餘試劑均為國產AR級。

　　1.2　儀器與設備

　　DU-7紫外分光光度計，JA-21高速低溫離心機，Beckman公司產品。Gene Pulsar^TM電穿孔儀，Bio-Rad公司產品。UR-200P超聲破碎儀，日本Tomy Seiko公司產品。

　　1.3　菌株及培養基

　　1.3.1　標準產酶菌株P.mirabilis VIr的構建　　奇異變形杆菌P.mirabilis VI由本室保存，耐藥質粒P^MD101由德國達木土塔微生物研究所Martin教授惠贈。P^MD101經高壓電穿孔法導入P.mirabilis VI構建成標準產酶菌株P.mirabilis VIr，產β-內酰胺酶AmpC。構建的新菌經抗性篩選、尿素酶試驗、吲哚試驗等生化試驗及藥敏試驗和棒酸抑製試驗鑒定後用於本實驗。

　　1.3.2　奇異變形杆菌臨床分離菌株106 s　　由第三軍醫大學第二附屬醫院檢驗科分離鑒定，編號為106，對本實驗中采用的各種抗生素均敏感。

　　1.3.3　波動Ⅰ號平板　胰蛋白腖1%，酵母抽提物0.5%，氯化鈉1%，氯化三苯基四氮唑(TTC)0.01%，葡萄糖0.1%，TTC及葡萄糖於倒平板前加。

　　1.4　細菌潛生體及繁殖體的製備^［3］

　　將形態均一的短杆狀奇異變形杆菌點種於波動Ⅰ號平板中心，置每2h在34℃～39℃波動一個周期的孵箱中培養18～24 h，待平板上出現紅、黃交替的細菌環後，取紅環細菌即得繁殖體，取黃環細菌即得潛生體。

　　1.5　最低抑菌濃度(MIC)的測定

　　采用試管二倍稀釋法，細菌終濃度取10⁵CFU/ml,18～24 h後觀察結果，MIC測定均重複3次。

　　1.6　β-內酰胺酶製備及活性測定

　　從波動平板上分別收集細菌潛生體和繁殖體，於冰水浴中超聲破碎，裂解液於4℃，20000 g條件下超速離心1h，上清液即為粗酶液。以APC為底物，37℃條件下記錄單位時間內APC在204 nm處的吸光度變化，計算酶活性。酶活性單位為每毫克蛋白酶在37℃，pH7.0條件下，每分鍾水解APC的納摩爾數。酶活性測定均重複3次。

　　1.7　外膜通透性的測定

　　根據文獻［4］報道方法略加改進。將潛生體及繁殖體細胞用pH7.0 PBS緩衝液洗滌2次後，將菌體重新懸浮於PBS中，製成D₆₀₀=0.55的細菌懸液。加入一定濃度APC溶液，此時取出0 min樣品，離心取上清液，用紫外分光光度計於204 nm處測定上清液中抗生素含量。餘下的菌懸液置37℃恒溫搖床上放置30 min後，再測定上清液中抗生素含量。前後兩次測定結果比較，以細菌細胞對抗生素的吸收率代表細菌的外膜通透率。

　　1.8　外膜蛋白提取及電泳

　　相同濁度的潛生體及繁殖體菌懸液於冰水浴條件下超聲破碎，5000 r/min離心15 min以除去未破碎細胞。上清液於4℃，40000 r/min離心40 min得細胞膜沉澱，加入終濃度為1%的十二烷基肌氨酸鈉，室溫放置30 min，溶解內膜，經16400 r/min，室溫離心40 min得外膜沉澱，沉澱外膜蛋白用pH7.0 PBS懸浮，加0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟置-70℃保存^［5］。

　　SDS-PAGE按文獻［6］方法進行。

　　2　結果

　　2.1　奇異變形杆菌的潛生體與繁殖體

　　將奇異變形杆菌點種於波動Ⅰ號平板中心，24 h後平板上出現紅、黃交替的細菌環，紅環上的短小杆菌即繁殖體，黃環上的纖細狀長條菌即潛生體。

　　2.2　潛生體與繁殖體MIC比較，見表1

表1　奇異變形杆菌潛生體與繁殖體的MIC

　　tab 1　The MIC of cryptic-growth cells and vegetative cells of P.mirabilis

　　由表1可看出，潛生體MIC普遍高於繁殖體，差異程度為2～8倍不等。2.3　潛生體與繁殖體的β-內酰胺酶活性比較

　　β-內酰胺酶活性測定結果顯示，P.mirabilis潛生體與繁殖體酶活性分別為1220±55.1和1200±32.5，P.mirabilis 106 s潛生體與繁殖體酶活性為22±7.94和27.7±6.66，經Newman-Keuls法檢驗，兩個菌株的潛生體及繁殖體之間β-內酰胺酶活性均差異不顯著(P＞0.05)。

　　2.4　潛生體與繁殖體的外膜通透性

　　外膜通透性檢測結果顯示，P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s繁殖體外膜通透率為56.2%和62.4%，而二者潛生體的外膜通透率則僅為31.6%和27.4%，潛生體的外膜通透性較之繁殖體有較大幅度的減低。

　　2.5　SDS-PAGE檢測外膜蛋白

　　對P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s的潛生體、繁殖體外膜蛋白進行了SDS-PAGE檢測，電泳之前，將外膜蛋白樣品置於1×SDS凝膠加樣緩衝液中，100℃加熱3min使蛋白質變性，凝膠電泳結果見圖1。

圖（略）　　

　　從圖1中可看出，P.mirabilis VIr及P.mirabilis 106 s菌株中，潛生體除位於(34～38)×10³u的蛋白帶與每殖體含量大致相同外(38×10³u蛋白帶還略有增加)，其餘各蛋白帶僅隱約可見，含量明顯低於繁殖體，表現為外膜蛋白的大麵積減少。

　　3　討論

　　已有研究表明^［7］，奇異變形杆菌所導致的感染特別是上尿路感染與潛生體細胞的出現有密切關係，同時，有潛生體細胞存在的感染往往更為嚴重，在治療上也更為困難。這一方麵是由於潛生體細胞的鞭毛數量、尿素酶、苯丙氨酸脫氨酶及溶血素的產生量都大大多於繁殖體，毒力較強^［8］；另一方麵，也可能存在潛生體與繁殖體耐藥性差異上的原因。本實驗結果顯示潛生體細胞對本實驗中所采用的各種抗生素的MIC值普遍高於繁殖體，表明這種耐藥性差異是存在的。

　　關於革蘭氏陰性菌的耐藥機製，普遍認為主要涉及滅活酶的產生及外膜通透性兩個方麵^［9］。本研究選取了β-內酰胺酶作為滅活酶的代表，對產AmpC β-內酰胺酶的標準耐藥菌株P.mirabilis VIr及敏感菌株P.mirabilis 106 s中潛生體、繁殖體的β-內酰胺酶活性進行了比較，結果差異並不顯著(P＞0.05)，提示β-內酰胺酶等滅活酶的產生可能在潛生體與繁殖體間耐藥差異的發生中不起主要作用。在對潛生體與繁殖體外膜通透率的比較中，發現潛生體外膜通透率明顯低於繁殖體，進一步進行外膜蛋白的提取與電泳發現，兩個實驗菌株的潛生體細胞較之繁殖體細胞有大麵積的外膜蛋白表達減少或缺失。已有研究表明，革蘭氏陰性菌外膜蛋白中的膜孔蛋白(Porins)是許多物質包括抗生素進入胞內的重要通道，外膜蛋白的減少或缺失可能是膜孔蛋白的減少或缺失，從而使外膜通透率降低^［10］。此外，外膜蛋白的減少或缺失也可能影響除膜孔蛋白以外的其他類型的蛋白構成，從而影響膜通透性。本實驗中發現潛生體細胞對多種抗生素的MIC值均有不同程度的上升，這很可能與潛生體細胞中外膜蛋白的大麵積減少或缺失有著密切關係，因為減少或缺失的外膜蛋白中既可能包含了多種膜孔蛋白，也可能影響了其他類型的蛋白構成，表現出一種非特異性的耐藥程度提高。

　　奇異變形杆菌潛生體耐藥程度普遍高於繁殖體且二者之間可相互轉化的特性，很可能是奇異變形杆菌機會致病及導致慢性尿路感染的機製之一。當奇異變形杆菌處於營養缺乏的環境或應用了抗生素的條件下時，它很可能主要以潛生體細胞的形式存在，以一種代償性代謝轉變(如外膜蛋白的減少或缺失，合成鞭毛能力大大增強等)、抵抗力增強的方式存在，從而生存下來並導致疾病的發生。

　　國家自然科學基金資助項目，No.39370008

　　作者單位：黃春基　徐啟旺　叢延廣　第三軍醫大學生物波研究中心　重慶，400038

　　解曉珍　附屬新橋醫院檢驗科　重慶，400037

　　參考文獻

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　　3　劉俊康，郭　剛，徐啟旺，等.生物波理論的研究.中國微生態學雜誌，1994，6(6)：40

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