5種方法鑒定耐甲氧西林葡萄球菌的實驗比較

作者：魏惠永，董婷，黃革，陳輝，張豔蘋（廣東省老年醫學研究所實驗中心）

　我們采用Etest和聚合酶鏈反應(PCR)等5種方法對200株葡萄球菌的甲氧西林特性進行研究，分析各方法的準確性，探討建立鑒定耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的有效途徑，指導臨床診斷與治療。

　　1　材料與方法

　　1.1　菌株來源　200株葡萄球菌分離株由我所與廣州市紅十字會醫院提供，其種類經Vitek System鑒定，質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

　　1.2　藥敏試劑　BBL的苯唑青黴素藥敏紙片，含量為1 μg/片。Etest甲氧苯青黴素紙條為AB BIODISK產品，濃度為0.016～256 μg/ml。GPS-SB專用藥敏卡由生物-梅裏埃公司生產。

　　1.3　引物　針對MecA基因的引物序列參照Murakami^［1］的報道，由我所合成並純化。

　　1.4　主要儀器　PE9600型PCR儀，Vitek-60，UVP GDS8000型凝膠成像分析係統。

　　1.5　試驗方法　Vitek System、K-B法、Etest、瓊脂篩選法均根據操作說明與NCCLS標準進行，其中瓊脂篩選試驗中氯化鈉濃度為40 g/L，苯唑青黴素為4 μg/ml。聚合酶鏈反應中以酚、氯仿法提取DNA，基因擴增條件同Murakami^［1］的設計，產物檢測使用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠(15 g/L)進行電泳，紫外燈下見310 bp擴增片段者為陽性。

　　2　結果

　　2.1　葡萄球菌分類與來源　經Vitek係統鑒定，金黃色葡萄球菌(SA)為136株，凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)占64株，其中表皮葡萄球菌有21株，另外，21株為腐生、賽氏、溶血、模仿、華納五種葡萄球菌。從呼吸道分離的細菌占130株，泌尿生殖係統分離株為52，傷口等其它部位占18株。

　　2.2　甲氧西林藥敏試驗　瓊脂篩選法、Etest、Vitek System 3種方法篩選的耐甲氧西林葡萄球菌分別為118、117和108株。K-B法為120株耐藥，7株中介度，73株敏感。158株細菌可檢出MecA基因，僅42株為陰性PCR結果，參見表1。

　　2.3　對比研究　以瓊脂篩選法為參考標準，Etest、K-B、Vitek System三者鑒定耐甲氧西林葡萄球菌的符合率分為117/118，118/120和108/118。而聚合酶鏈反應的準確性僅為116/158。

表1　5種方法鑒定耐甲氧西林藥敏的結果

　　sA：金黃色葡萄球菌　CNS：凝固酶陰性葡萄球菌，S：敏感，R：耐藥，I：中介度。

　　3　討論

　　由於耐甲氧西林葡萄球菌具有表型的不穩定性與內部亞群的不均一性^［2］，故目前尚無理想方法可全部篩選出耐藥菌，各種方法的結果存在差異。我們在基本相同的條件下同步進行瓊脂篩選，Etest和K-B 3種方法檢測200株葡萄球菌，其結果基本一致。定性的K-B法雖易采用，但影響因素較多，需嚴格掌握實驗條件，目前僅作為初步篩選的手段，對可疑菌株需改用其它方法。Etest法結合了擴散法與稀釋法的優點，以連續濃度梯度方式測定抗生素MIC值，對葡萄球菌耐藥株的檢出率接近100%，由於價格昂貴，應用受到限製。

　　Vitek System采用微量稀釋法原理，以生長曲線變化來快速判讀受試菌的敏感性，目前對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測率超過95%。本文資料顯示，Vitek係統法的總體檢出率為91.5%，耐藥菌漏診率達8.5%，其中凝固酶陰性葡萄球菌居多，提示根據Vitek係統快速鑒定結果作出該菌敏感性的報告需慎重。

　　近年來有聚合酶鏈反應檢測葡萄球菌耐藥基因以篩選耐藥菌株的報道^［3］。本文對200株細菌進行MecA基因擴增，有158株為陽性結果，其檢出率為79%，與上述培養法有較大差異。由於多數葡萄球菌內存在MecA基因，少數耐藥菌缺失該基因，且耐藥基因的檢出並非等同於細菌耐藥性，因此現階段聚合酶鏈反應在篩選耐甲氧西林葡萄球菌中的作用有限。

　　參考文獻

　　1　Murakami K W, Minamide K, et al. Identification of methicillin

　　-resistant strains of Staphylococci by polymerase Chain reaction.J Clin Microbiol，1991，29：2 240

　　2　Hartman B J,Tomasz A.Low-affinity penicillin-binding protein associated with beta-lactam resistance in staphylococcus aureus.J Bacteriol，1984，158：513

　　3　Predaric S C,Ligozzi M,Fontana R. Genotypic identification of methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci by polymerase Chain reaction. Antimicrob Agents Chemother，1991，35：2 568

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