厭氧菌微量生化板的研製

作者：李建秋　　　吳曉岩　　　熊德鑫　

摘　要：利用預成酶的原理，研製厭氧菌微量生化鑒定板，用國際標準菌株檢測其符合率達95.9%，重複率達96.33%。用已知引進參考菌株檢測，其符合率達94.84%，重複率達94.33%，而對臨床分離的革蘭陰性細菌的符合率達81%，對臨床分離的革蘭陽性細菌符合率達90%，此法效果與國外API-20A產品效果類似，但此法具有快速，操作簡便，重複性好等優點，值得在廣大臨床檢測中推廣和普及。

　　 關鍵詞：厭氧菌　微量生化板　快速診斷

　　早在70年代，我們就采用微量技術對微生物生化性狀進行檢測，以鑒定微生物的種屬。從簡易裝置開發原理來說，它大致包括兩大類產品，一類屬於微量接種生長繁殖，再與培養基底物產生反應而用於微生物的生化性狀的鑒定，這類裝置與傳統的微管法類似，如API微量係統，它就是利用微型杯的塑料板，幹燥底物，使用時往杯中滴入菌懸液，經過培養一段時間後，再觀察其培養基中指示劑改變情況。API係統根據對不同類細菌鑒定的需要又分成4大類，如AIP-20A係統用於鑒定厭氧菌，API-20C用於鑒定酵母菌，此套係統對厭氧菌鑒定的符合率為(80～90)%。另一大類快速生化檢測裝置是利用預成酶的原理，根據酶與底物的專一性反應，不需依賴細菌生長，而能快速鑒定厭氧菌的生化性狀，如國內熊德鑫教授的微量生化板法。我們依據微量生化板法原理加以改良，開發出“厭氧菌微量生化板”用於部分菌種鑒定，結果報告如下：

　　1　材料與方法

　　1.1　根據資料^［3］　配製簡易生化鑒定20A厭氧菌生化板若幹。

　　1.2　指示劑的配置　溴麝香草酚藍-甲基紅指示劑，又簡稱為BTB-MR液，甲基紅溶液：稱取甲基紅20g，緩衝液加入0.02mol/L，NaOH約30ml，不研磨直至甲基紅完全溶解，加蒸餾水至100ml，儲存於棕色瓶中放冰箱保存。0.4%溴麝香草芬藍溶液，稱取TBT0.4g，緩衝液加入0.02mol/L naOH約(30～35)ml，研磨直至完全溶解，加蒸餾水至100ml，儲存於棕色瓶中放冰箱保存。臨用時將上述兩種試劑分別用蒸餾水稀釋5倍後1∶1混合即可使用。

　　1.3　操作

　　1.3.1　被檢菌液的製備　從厭氧培養48h培養物用無菌棉簽洗至無菌試管中，測定菌液OD值為4.0～8.0(相當於15億/ml～30億/ml)。

　　1.3.2　加入菌液　現將製備菌液置振蕩器上振蕩(10～20)sec，使其混均後再用滅菌巴氏管將菌液加入微量反應板小孔中，將反應板置濕溶器盒內35℃普通培養箱(4～6)h後觀察結果。

　　1.3.3　每次試驗都設陰性和陽性對照　陰性對照用PBS液加入，內含指示劑為淺綠色；陽性對照：吲哚試驗，具核梭杆菌具核亞種ATCC25586，七葉水解，脆弱類杆 菌ATCC25285，硝酸鹽還原：痤瘡丙酸杆菌(本室分離株)；觸酶試驗：使用脆弱類杆菌ATCC25285；尿素酶：使用本室分離的類杆菌。

　　1.4　結果判定

　　1.4.1　糖發酵試驗　每個試驗孔加入BTB-MR液一滴，磚紅色為強陽性(++)，黃色為(+)，綠色為陰性(-)。

　　1.4.2　吲哚試驗　加Kovacs試劑1滴，出現粉紅色為陽性，無顏色為陰性。

　　1.4.3　硝酸鹽還原試驗　先加入A試劑(0.5%α-奈胺後加入B試劑(0.8%磺胺酸)各一滴，出現紅色為陽性(+)，無顏色為陰性。

　　1.4.4　七葉苷水解　黑色為陽性(+)，無色為陰性(-)。

　　1.4.5　尿素酶　粉紅色為陽性(+)，橙黃色為陰性(-)。

　　1.4.6　觸酶產生　在甘露醇中滴入10%H₂O₂，產生氣泡者為陽性，不產生氣泡為陰性。

　　2　結　果

　　2.2　用國際標準菌株使用API-20A與厭氧菌微量生化板鑒定結果比較列於表1中。

表1　國際標準菌株使用API-20A與厭氧菌微量生化板鑒定結果比較

　　2.2　已知參考菌株使用API-20A與厭氧菌微量生化鑒定結果比較列於表2中。

表2　已知參考菌株使用API-20A與厭氧菌微量生化鑒定結果比較

　　2.3　對臨床革蘭陰性菌分離株的鑒定比較列於表3中。

表3　對臨床革蘭陰性菌分離株的鑒定比較

　　2.4　對臨床革蘭陽性菌分離株的鑒定比較列於表4中。

表4　對臨床革蘭陽性菌分離株的鑒定比較

　　3　討　論　　厭氧菌微量生化板鑒定法是利用預成酶與底物專一反應，不依賴細菌生長既能快速鑒定厭氧菌的生化方法。而API-20A仍然是定量接種被檢測菌經48h培養生長後，細菌產生特異性酶與加入底物專一反應使pH改變而引起預先加入指示劑改變顏色，以鑒定厭氧菌的生化性狀方法。據

　　adeny使用API-20A鑒定係統證實，其符合率(80～90)%，我們使用API-20A對臨床分離厭氧菌株鑒定符合率達(83～86)%，與國外鑒定資料類似。我們使用厭氧菌微量生化板鑒定法鑒定國際標準菌株符合率為95.92%，重複率為96.33%，均優於API-20A鑒定方法，並且此法不僅重複率及符合率高，而且具有快速鑒定特點，一般6h即可觀察結果，而API-20A法需48h觀察結果；同時厭氧菌微量生化板法不需要厭氧培養，置37℃培養箱中(4～6)h即可觀察結果。可見厭氧菌微量生化板鑒定方法不需要特殊培養基，試劑用量少，成本低廉，操作簡便，不需特殊儀器，待檢菌株懸液且可在冰箱中保存一段時間，結果不影響，而API-20A等以往常規的管生化，操作程序繁瑣，觀察時間一般48h以上，待檢菌株不宜保存，一般需立即進行生化鑒定。當然厭氧菌微量生化板結果受菌液濃度的影響，一般菌液濃度OD值在4.0～8.0(約15～30億/ml)其反應最佳時間(4～6)h，如菌液濃度低於此濃度則需延長反應時間，如菌液濃度過高，而反應時間又長，則可能出現假陽性而使鑒定的符合率降低。總之兩種生化鑒定方法各有利弊，但主快速檢測這點來說還是選擇厭氧菌生化反應板鑒定方法為好。

　　作者單位：李建秋　黑龍江省醫院，150036

　　吳曉岩　黑龍江省醫院，150036

　　熊德鑫　北京解放軍304醫院，100037

　　參考文獻

　　［1］Hansen SL,Stewart RJ.J Cline microboiol,1976,4:227.

　　［2］Moore HB,Sutler VL,Finegold SM.J Cline microbiol 1975,7: 15.

　　［3］熊德鑫編譯.厭氧菌分離和堅定方法.江西科技出版社出版，1989，9～11.

　　［4］Adney WS,Jones BL.J Cline Microbial,1985,22(67):980

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