自製兩種淋病奈瑟菌選擇培養基的應用觀察

摘要　研製一種質優價廉的新型Neissera gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)選擇培養基。以MH瓊脂為基礎添加營養成份和抗生素製成MH嬰牛血清培養基(MHSM)與MH蛋黃培養基(MHEM)，將52株已分離純化鑒定的淋病奈瑟菌和泌尿生殖道常見寄居菌等量接種至以上兩種培養基和對照市售淋病奈瑟菌培養基(MNCM)上，相同條件下培養，觀察3種培養基支持淋病奈瑟菌生長和雜菌抑製能力。結果，淋病奈瑟菌在所製培養基上生長快，菌落出現早且大，生長率高，與MNCM比較有顯著性差異(P＜0.05)，且MHSM及MHEM抑製雜菌的能力也明顯優於MNCM。

　　N.gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)培養雖困難，但目前為止WHO仍規定培養法是診斷淋病奈瑟菌感染的標準方法。我們以MH瓊脂為基礎製作的嬰牛血清培養基(MHSM)和蛋黃培養基(MHEM)，經與市售商品培養基比較，效果滿意。現將結果報告如下。

　　 1　材料與方法

　　1.1　培養基

　　1.1.1　自製MH嬰牛血清培養基(MHSM)　MH瓊脂(購自浙江省軍區後勤衛生防疫檢驗所)3.6 g，20 g/dl酵母透析液1.0 ml，玉米澱粉0.5 g，葡萄糖0.1 g，以上成份溶於100 ml H₂O中，121°C，15 min滅菌後冷至60°C左右，加入室溫預置的嬰牛血清(天達生物工程有限公司)10 ml～15 ml，萬古黴素0.3 mg，多粘菌素B 0.25 mg，製成MHSM。

　　1.1.2　自製MH蛋黃培養基(MHEM)　將上述培養基成份中的嬰牛血清換成50 g/dl無菌蛋黃生理鹽水液10 ml～15 ml即可。

　　1.1.3　市售改良淋病奈瑟菌選擇培養基(購自浙江軍區後勤衛生防疫檢驗所)，按說明製備時加入5%～10%羊／人紅細胞，製成巧克力培養基(暫以MNCM命名)。

　　1.1.4　TM培養基　英國OXIOD公司，用於淋病奈瑟菌的分離分純培養。

　　1.1.5　奈瑟菌微量生化鑒定培養基，購自浙江軍區後勤衛生防疫檢驗所，用於淋病奈瑟菌鑒定。

　　1.2　標本來源及鑒定　52株淋病奈瑟菌標本分別來自重慶市第一人民醫院性病防治中心、解放軍324醫院及本院臨床標本分離所得，全部由本室經過係統鑒定確認。塗片染色鏡檢，革蘭陰性雙球菌，呈腎型或蠶豆形，成對排列；氧化酶試驗陽性；分解葡萄糖，不分解蔗糖、乳糖和麥芽糖；不還原硝酸鹽；普通瓊脂及22°C不生長。

　　1.3　三種培養基支持淋病奈瑟菌生長能力測定　將52株已分離純化的淋病奈瑟菌單個菌落分別等量分區劃線接種至3種培養基上，置燭缸(缸內保持充分濕度)，35°C～36°C培養，於24 h及48 h觀察菌落形成情況及雜菌汙染情況。

　　1.4　雜菌抑製試驗　分別將大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、普通變形杆菌ATCC13315、結腸耶爾森菌(本室保留菌種)傳代培養後，挑取單個菌落以生理鹽水製成0.5麥氏濁度懸液(相當於1.5×10⁸CFU／ml)並倍比稀釋成1.5×10⁷～1.5×10²CFU/ml濃度，取不同濃度菌液分別等量(5 μl)接種至三種培養基上，置燭缸，35°C～36°C培養。逐日觀察其生長情況。

　　 2　結果

　　2.1　52株淋病奈瑟菌的生長情況見表1。培養24 h觀察，MHSM、MHEM上菌落形成有顯著性差異(χ²分別為4.02和5.34，P值分別＜0.05和＜0.01)，而繼續培養至48 h，兩者的菌落形成率雖高於MNCM，但其差別無統計學意義。52株淋病奈瑟菌在MHSM、MHEM和MNCM上的平均菌落直徑(x±s)分別為0.7±0.14 mm、0.76±0.18 mm、0.40±0.12 mm，與MNCM比較，t值分別為2.431和2.562；均P＜0.05。可見，新培養基對於促進淋病奈瑟菌快速生長，提高早期陽性檢出率可能有重要意義。

表1　52株淋病奈瑟菌在3種培養基上的生長率比較

　　(注：*MHSM與MNCM比較，χ²＝4.02，P＜0.05；**MHEM與MNCM比較，χ²＝5.34，P＜0.01)

　　2.2　雜菌抑製情況見表2。

表2　試驗雜菌在3種培養基上可生長濃度(CFU／ml)

　　2.3　環境中雜菌在3種培養基上的汙染情況　隨培養時間延長和啟蓋次數增加，雜菌汙染程度愈重。24 h汙染率分別為MHSM 0%，MHEM 0%，MNCM 8.3%，48 h汙染率分別為4.0%，7.8%，20.4%。

　　3　討論

　　淋病奈瑟菌生長需要豐富的營養，長期沿用以進口GC粉為基礎的TM，MTM或NYC培養，因添加成份複雜，製作麻煩且成本高，使其在臨床上的應用推廣受到限製。國內許多單位尤其在基層仍然采用普通巧克力培養基或商品淋病奈瑟菌選擇性培養基，不但成本高，有的效果也欠佳，造成許多漏檢。

　　本文觀察結果表明，MHSM、MHEM支持淋病奈瑟菌生長和雜菌抑製能力均明顯優於MNCM，24 h生長率顯著高於MNCM(P＜0.05或＜0.01)。MH主要成分為水解酪蛋白，而嬰牛血清或蛋黃均含豐富營養成份，為淋病奈瑟菌生長提供了良好營養基礎，酵母透析液已除去酵母中小分子毒性物質並含多種生長因子，玉米澱粉能吸附標本和培養基中對淋病奈瑟菌有毒的物質，可促進生長。培養48 h，在MHSM上形成中等大小、圓／橢圓形，淺灰白色，光滑濕潤的菌落；在MHEM上則無色，半透明，呈露滴狀，繼續培養，菌落增大，邊緣呈花瓣狀。均易從顏色和形態上與其他類菌落相區別。與鏈球菌或類白喉棒狀杆菌等菌落相似時，塗片染色鏡檢即可加以區別。而MNCM上淋病奈瑟菌的菌落太小，形態不夠典型，易被雜菌覆蓋而漏檢。

　　實驗中發現，溫度和濕度對淋病奈瑟菌培養影響大，燭缸內應置無菌H₂O並定期更換，以保持缸內有充分濕度並防止汙染。同時，嚴格控製溫度在35°C～36°C，超過此範圍，則生長慢、菌落小、易漏檢。

　　參考文獻

　　1　鄭彩蘭主編.臨床皮膚性病學指南.北京：北京科學技術出版社.1996.256

　　內應置無菌H₂O並定期更換，以保持缸內有充分濕度並防止汙染。同時，嚴格控製溫度在35°C～36°C，超過此範圍，則生長慢、菌落小、易漏檢。

　　參考文獻

　　1　鄭彩蘭主編.臨床皮膚性病學指南.北京：北京科學技術出版社.1996.256

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