【摘要】目的 探討噬菌體法進行結核杆菌快速培養的特異性及敏感性以及該方法與傳統方法的同源性。 方法 應用噬菌體法進行結核分支杆菌、牛分支杆菌以及非結核分支杆菌的培養;同時應用噬菌體法與傳統的羅氏培養法進行結核菌培養及藥敏測定。結果 該方法檢出最低濃度為103CFU/ml，特異性達到100%，藥敏實驗同傳統方法的符合率為83.3%，臨床塗陽培陽標本18例，本法陽性16例，檢出率為88.8%，塗陰培陽標本15例，本法陽性8例，檢出率為53.5%，塗陰培陰標本17例，本法陽性4例，檢出率為23.5%。結論 噬菌體裂解法具有很高的敏感性和特異性，同時與傳統方法比較具有較高的藥敏符合率。
【關鍵詞】 噬菌體 結核分支杆菌
現在大部分地區肺結核患者的診斷是依靠實驗室診斷、臨床症狀和體征，而實驗室診斷最主要是依靠從有症狀的初次就診病人的痰液標本進行常規的塗片顯微鏡檢查，痰液塗片顯微鏡檢查將篩選大部分的結核感染病例。然而，眾所周知，這種檢查方法將漏診很多的結核感染病人，這些漏診的病人就是感染源。經過消化處理或去汙染處理的痰標本結核杆菌培養方法是診斷肺結核的較為敏感的方法，然而這種方法需要耗費幾周的時間，從而不能及時診斷肺結核，導致結核病的傳播。因而結核病細菌學快速檢查曆來是國內外學者所關注的熱門課題［1，2］ 。
目前耐藥、流動人口、HIV感染已經成為當今結核病控製所麵臨的三大難題。其中耐藥性是我國結核病起主要限製性作用的因素。因而結核菌的培養和藥敏結果在結核病的防治中起著重要作用。
我們通過噬菌體裂解法對結核分支杆菌及非分支杆菌進行了快速培養與鑒定，同時進行了藥物敏感性測定，並與傳統的羅氏培養法進行了比較。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料 結核分支杆菌快速診斷試劑盒（Fast plaque TB TM ）由北京華誠沛豐生物技術有限公司提供。結核分支杆菌、牛分支杆菌、銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌來自吉林市結核病防治研究所臨床菌株。結核病患者痰標本50份，其中塗陽培陽標本18份，塗陰培陽標本15份，塗陰培陰標本17份。
1.2 方法 按試劑說明書操作，主要步驟如下。
2 結果
2.1 應用10例結核分枝杆菌分別在10 2 、10 3 、10 4 、10 5 、10 7 CFU/ml濃度，（Mcfarland3.0濁度相當於細菌濃度107CFU/ml）進行噬菌體法檢測結核菌。該方法檢出最低濃度為103CFU/ml。詳見表1。
表1 噬菌體法檢測不同濃度結核菌的結果（略）
2.2 噬菌體法結核菌培養的特異性實驗 銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌4種呼吸道常見細菌各10株應用噬菌體法檢測均為陰性。牛分支杆菌、結核分支杆菌各10株，進行噬菌體法結核菌檢測均為陽性。（菌液濃度均為10 5 CFU/ml）其特異性達到100%。
2.3 噬菌體法進行藥物耐藥性分析，噬菌體法藥敏實驗同傳統方法的符合率為83.3%，分別為S90%、R90%、H70%。詳見表2。
2.4 肺結核患者臨床痰標本50株，直接進行噬菌體法結核菌檢測。塗陽培陽標本檢出率為88.8%，塗陰培陽標本檢出率為53.3%，塗陰培陰標本檢出率為23.5%，詳見表3。
表2 噬菌體法與傳統羅氏法兩種方法藥敏實驗的比較（略）
注:敏感“-”，耐藥“+”，羅氏法低濃度耐藥高濃度敏感“+-”;噬菌體法菌液濃度均為10 4 CFU/ml;噬菌體法可疑“?”
表3 50例肺結核患者臨床痰標本的噬菌體法檢測結果（略）
3 討論
分支杆菌噬菌體在1947年由Gardner首次分離並命名，之後，不同種分支杆菌噬菌體陸續被分離，至今已分離出250餘種 ［3］ 。隨著人類對噬菌體結構和功能的不斷認識，噬菌體作為一種研究工具的功能正逐步被開發，一些相關機製如L5、D29的全基因序列已逐步被闡明 ［4］。近20年來，分支杆菌噬菌體廣泛用於DNA重組技術中，並已在分支杆菌快速鑒定及藥物敏感性試驗中得以廣泛應用［5，6］ 。北京華誠沛豐生物技術有限公司提供的FAST Plauqe TB是一種用噬菌體方法檢測待檢標本中是否存在活的結核分支杆菌的檢測方法。該方法的基本原理是分支杆菌噬菌體隻能感染相應的活的分支杆菌，如待檢標本中無相應的分支杆菌，則噬菌體被隨後加入的殺毒劑全部殺死，因而後加入的提示細胞未受噬菌體感染，隻能在培養皿中生長繁殖，無噬菌斑出現［7］ 。但如待檢標本中有相應的分支杆菌，則噬菌體侵入菌體內，免遭殺毒劑破壞，並在菌體內大量增殖，最終裂解菌體，釋放出來的噬菌體即可感染指示細胞，並使指示細胞裂解出現噬菌斑。因此，隻要根據噬菌斑的有無，即可確定待檢標本中是否含有相應的活的分支杆菌。
本研究結果表明，菌液濃度達到10 3 CFU/ml就能檢測出來（塗片檢出濃度為10 4 CFU/ml），因此具有較高的靈敏度。特異性試驗結果表明隻有結核分支杆菌才出現陽性結果，而4種呼吸道常見菌檢測結果均為陰性，說明特異性達到100%。藥敏實驗結果表明本法與傳統羅氏培養法的藥敏符合率達到83.3%，說明二者之間具有較好的同源性。臨床標本檢驗結果表明，塗陽培陽標本檢出率為88.8%，塗陰培陽標本檢出率為53.3%，塗陰培陰標本檢出率為23.5%，平均檢出率達到56.0%，大大高於塗片30%的檢出率。而報告時間（2～4天）明顯低於傳統方法培養所需要的時間（2～3個月）。由上述研究結果可看出，本法快速、簡便，同時具有很高的敏感性和特異性，是一種較理想、有發展前途、對結核病有診斷及治療意義的新方法。同時，由於噬菌體的裂解作用，實驗過程中能將結核分支杆菌殺死，對實驗操作人員有保護作用，而且無須特殊儀器，成本低廉，易於我國實驗室推廣［8，9］ 。
參考文獻
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