【摘要】 目的用超低溫方法保存青天葵組培物。方法采用單因子比較法、均勻設計法考察生長周齡、冷凍保護劑、預培養時間、降溫方式、化凍方式等因素對青天葵組培物超低溫保存後細胞生活力的影響。結果青天葵組培物較佳的超低溫保存程序為：５ 周齡的組培物，在４ ℃進行低溫鍛煉１２ ｄ，以１２．５ ％ＤＭＳＯ ＋０．２５％ＬＨ 為冷凍保護劑，在４℃靜置處理３０ ｍｉｎ，然後在－１８℃，停留１ ｈ 後投入液氮中保存，材料取出後，在２０℃化凍，無菌洗滌後，再接種，組培物能夠存活並繼續生長。結論超低溫保存方式可以成功保存青天葵組培物種質資源。
青天葵別名獨葉蓮、青蓮、天葵、芋蘭等，來源於蘭科多年生宿根草本植物毛唇芋蘭Nervilia fordii （Ｈａｎｃｅ） Ｓｃｈｌｔｒ．，以葉或帶塊莖的葉入藥［１］，有清肺止咳、健脾消積、鎮靜止痛、清熱解毒、散結消鬁之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、瘰鬁、腫毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等，對小兒肺炎有特效。
由於青天葵種子無胚乳，僅靠無性繁殖，自然繁殖數量少，繁殖係數極低，資源分布極其有限。多年來，因亂采亂挖，多是連葉帶塊莖采挖加工，導致野生青天葵資源日益枯竭。
我們已經開展青天葵組織培養及植株再生的研究工作［２］ ，本研究青天葵組培物超低溫保存的影響因素，為青天葵資源再生和種質保存提供技術資料和理論依據。
１ 材料與方法
１．１ 材料本實驗所用青天葵組培物是由青天葵球莖誘導產生的根狀莖。在含有６ －ＢＡ２ ｍｇ• Ｌ－１ 的ＭＳ 培養基上進行繼代培養。培養溫度（２５ ±２）℃，每天光照１２ ｈ，光照強度１２００ Ｌｘ。經不同周齡對比試驗後，采用５ 周齡的組培物作為超低溫保存的試驗材料。
１．２ 方法
１．２．１ 冷凍保護劑考察ＤＭＳＯ，Ｇｌｙ（甘油），ＰＥＧ（聚乙二醇），Ｓｕｃ（蔗糖），Ｇｌｕ（葡萄糖），ＬＨ（水解酪蛋白）６ 種冷凍保護劑及其不同濃度配比的冷凍保護效果。
１．２．２ 預培養將組培物轉至含５％ＤＭＳＯ（二甲基亞碸）的ＭＳ培養基上，置於４℃進行零上低溫鍛煉。考察在此條件下預培養時間對超低溫保存後細胞生活力的影響。
１．２．３ 冷凍程序將組培物放入５ ｍｌ 聚乙烯塑料冷凍管中，加入０℃預冷的保護劑，使之淹沒組培物，旋緊管塞，在４ ℃靜置處理３０ ｍｉｎ。然後將冷凍管放入－１８℃，停留一定時間後投入液氮中保存。考察在－１８ ℃溫度下停留不同時間（０．５，１，２，３，４，５，６，７，８ ｈ），對超低溫保存後細胞生活力的影響。
１．２．４ 化凍與洗滌材料從液氮中取出化凍。考察不同的化凍方式：４℃零上低溫，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０℃的化凍效果。
待冷凍管中的冰融化後，立即加入ＭＳ 培養液（大量元素＋３％蔗糖），輕輕振搖，停留１０ ｍｉｎ，傾出溶液，如此反複洗滌３～５次。
１．２．５ 細胞生活力的檢測按簡令成［３］報道的方法：稱取洗滌後的組培物２００ ｍｇ，加入５ｍｌ 氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）液，在黑暗條件下靜置染色２０ ｈ。吸去ＴＴＣ 液，用蒸餾水洗滌３ 次。加入丙醇研磨提取ＴＴＣ 被脫氫酶還原後生成的紅色甲。用７５５ 型分光光度計，在４９０ ｎｍ 處測試丙醇提取液的吸收值。用這個吸收值（ＴＴＣ）值表示各處理的愈傷組織經超低溫保存後的細胞生活力。
２ 結果分析
２．１ 組培物生長周齡對超低溫保存後細胞生活力的影響細胞抗凍能力的提高與其分裂和生長活動等生理狀態密切相關。取轉移到新鮮培養基上的組培物，考察不同的生長周齡（１，２，３，４，５，６，７ 周）對組培物經超低溫保存後的細胞生活力。
由圖１ 知，將組培物轉移至新鮮培養基上，開始１ 周，冷凍後細胞的ＴＴＣ 值較低，說明細胞的抗凍能力弱，培養至第２ 周時，ＴＴＣ 值迅速升高，細胞抗凍能力顯著增強，第５ 周的ＴＴＣ 值最高，此時細胞的抗凍能力最強，此後，隨著培養周齡的增加，ＴＴＣ值呈下降趨勢，細胞抗凍能力逐漸減弱。因此選擇５ 周齡的組培物作為超低溫保存的材料是適宜的。
２．２ 冷凍保護劑對超低溫保存後細胞生活力的影響結果見表１～２。
表1 U12（12）12均勻設計因子水平（略）
按表１ 均勻設計搭配，組合成１２ 種方案進行試驗，結果見表２。
表2 U12（12）12均勻設計實驗安排及結果（略）
數據經逐步回歸處理，得到方程Y ＝０．３６９ ＋０．００４X１２ ＋４．４９５X６２ ，R ＝０．９０７ ＞０．９，F ＝２０．９２５ ＞F（７，４） ＝１４．６８，方程有顯著性意義。由方程知，Ｘ１２ 和Ｘ２２ 對Ｙ 值有顯著影響，均與Ｙ 值呈正相關。對方程優化得X１ ＝１２．５，X６ ＝０．２５，將其代入方程，得到優化值１．２７５，按公式計算。當α＝０．１０，Uα ＝１．６４４ ８，計算優化值區間估計為Y ＝１．２７５ ±１．６４４ ８×０．１２，即１．０７８ ～１．４７２。按照優化條件進行試驗，得到TTC 值為１．２８１，在Y 值區域內，且比１２ 次均勻試驗Y 值都高，說明所得結果是正確的，因此認為１２．５％ＤＭＳＯ ＋０．２５％ＬＨ是青天葵組織培養物較佳的冷凍保護劑。
２．３ 組培物預培養時間對超低溫保存後細胞生活力的影響結果見圖２。圖２ 表明，未經預培養的組培物，細胞TTC 值最低，抗凍能力較弱，預培養３ ｄ 後，TTC 值開始上升，細胞抗凍能力逐漸增強，到１２ ｄ 時TTC 值達最大，此時細胞抗凍能力最強，此後延長預培養時間，TTC 值呈下降趨勢，因此試驗材料應在４℃預培養１２ ｄ 後再進行超低溫保存。
２．４ 降溫方式對超低溫保存後細胞生活力的影響實驗比較快凍法（從０℃直接投入液氮中保存）和兩步冷凍法的冷凍效果，著重考察兩步法中在－１８℃停留不同時間（０．５，１，２，３，４，５，６，７，８ ｈ）對冷凍保存後細胞生活力的影響。結果見圖３。
圖3 降溫方式對冷凍後細胞生活力的影響（略）
圖３ 表明，兩步冷凍法的效果優於快速冷凍法，采用兩步冷凍法從０℃緩慢降溫至－１８℃時，不立即投入液氮中而在此溫度下停留１ ｈ，冷凍後細胞生活力明顯提高，因此降溫方式以從０℃降溫至－１８℃，停留１ ｈ，然後投入液氮保存。
２．５ 化霜凍方式對超低溫保存後細胞生活力的影響結果見圖４。圖４ 表明，冰箱內４℃化凍和４０℃以上高溫化凍的TTC值較低，細胞生活力較弱，１０℃和３０℃化凍效果接近，２０℃化凍TTC值最高，說明化凍後細胞保持了較高的生活力，因此２０℃化凍是較好的化凍方式。
圖4 化凍方式對冷凍後細胞生活力的影響（略）
２．６ 超低溫保存後組培物的再生長將化凍後的組培物，用無菌的ＭＳ 液衝洗後，轉移至新鮮培養基上，先黑暗培養２ 周，後進行光照培養，組培物能夠存活，統計存活率為６６．７％，將其轉移至新的培養基上根狀莖可以繼續生長並有新的根狀莖從節的部位生出。
【參考文獻】
［1］ 江蘇新醫學院．中藥大辭典，上冊［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９９３：１２３１．
［2］ 杜 勤，陳文利，王振華，等．青天葵組織培養和植株再生研究［Ｊ］．中國中藥雜誌，２００５，３（１）：８１２．
［3］ 簡令成，孫德蘭，孫龍華．甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究［Ｊ］．植物學報，１９８７，２９（２）：１２３．
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