誌賀菌的質粒譜及耐藥性分析
錄入時間:2010-11-24 13:13:27
來源：維普數據庫
我們用3′端特異性引物聚合酶鏈反應(3′BS-PCR)分析原理，將慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清及白細胞內的乙肝病毒(HBV)前C區1 896位點突變的突變型及野生型分離，探討HBV有意義突變中，最常見的1 896位點突變在外周血白細胞內的存在狀態，結合臨床進一步闡明乙肝的發病機理。
一、材料和方法
1.標本來源：經酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測及HBV DNA檢測均陽性的乙肝患者101例，均為我院1996年2月～1998年2月門診及住院病例。其中男67例，女34例；年齡7～72歲，平均34.4歲。
2.血清及白細胞內DNA提取：血清DNA提取按常規方法進行。白細胞內DNA提取：取200 μl依地酸(EDTA)抗凝血於0.5 ml離心管中離心，棄上清，加白細胞分離液50 μl和雙蒸水200 μl混勻，離心並棄上清後，用上法再重複1次。沉澱加入裂解液，置100℃水浴10分鍾。
3.PCR引物及反應條件：采用文獻［1-3］報道的3′BS-PCR引物核苷酸序列設計原理，設計合成3條引物，第1，2兩條引物的堿基位置在1 879～1 896這一區段，第3條引物的堿基位置在2 270～2 287這一區段，1，2兩條引物3′端最後一個堿基分別對應於野生株和突變株，第3條引物分別與1，2兩條引物構成PCR引物對。以下兩對引物(分別用Ⅰ和Ⅱ表示)擴增產物長度為520 bp。在40 μl反應體係中含適量引物、dNTPs、0.01%苯磺酸、Taq-DNA聚合酶和8 μl標本。PCR經預變性共32個循環。
二、結果和討論
1.3′BS-PCR檢測白細胞內HBV DNA點突變結果。引物Ⅱ擴增HBV DNA陽性者即突變株12例，兩種引物擴增均陽性者23例，均陰性者44例。突變總檢出率34.5%，其中單純突變株檢出率11.8%，野生株與突變株同時檢出率22.7%。
2.白細胞內HBV標誌與血清中HBV標誌的關係。目前人們對外周血單個核細胞(PBMCs)中的HBV DNA與血清中HBV DNA的關係存在著不同意見。有認為兩者關係不明確，有的則認為兩者有一致性的傾向。從本組白細胞內野生株與突變株同時檢出的23例中，有2例在血清中未檢出，單純突變株的12例及單純野生株的22例血清中，也各有1例未檢出，可見兩者之間的關係並不很明確，還有待進一步研究。但可提示血清中HBV DNA陰性的患者白細胞內不僅有野生株和突變株感染，而且突變株和野生株可同時存在。
3.慢性乙肝患者PBMCs內不僅普遍存在HBV DNA，而且還存在HBV突變株。從本組白細胞內野生株的總檢出率44.6%(45/101)與Moraleda等PBMCs HBV DNA檢出率44.4%(115/259)一致，以及本組白細胞內突變株總檢出率34.6%(35/101)分析，認為：(1)用3′BS-PCR在慢性乙肝患者的白細胞中分離出野生株及突變株，是一種較能準確反映乙肝患者HBV DNA及HBV突變株存在狀態的方法。(2)慢性乙肝患者白細胞內不僅普遍存在HBV DNA，同時還存在HBV突變株。
4.檢測慢性肝炎白細胞內HBV DNA前C區突變，可能能間接地反映肝細胞內HBV DNA突變株的存在狀態。有研究發現，肝細胞內HBV DNA和PBMCs內HBV DNA的存在之間有直接關係，不管患者是否經過抗病毒治療，當肝HBV DNA逐漸消失時，帶有HBV DNA的PBMCs的數量也相應減少。
參考文獻
1 朱濱，王國荃.基因診斷技術進展.中華醫學檢驗雜誌，1996，19：298-299.
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3 王小飛，劉華瑞，王錦榮，等.乙型肝炎和肝癌患者乙型肝炎病毒前C區1896位點突變的研究.中華傳染病雜誌，1996，14：11-12
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