金黃色葡萄球菌隨機引物擴增DNA多態性的分型研究
錄入時間:2010-11-24 11:32:37
來源：CNKI
隨機擴增DNA的多態性(RAPD-DNA)分型是近年來繼質粒譜分析、脈衝場電泳、探針雜交等分子生物學分型方法之後，發展起來的又一基因分型技術，在建立後的短短幾年內，它已在醫院感染菌株基因多態性分析中，顯示了巨大的優勢。為此，我們對金黃色葡萄球菌進行RAPD基因分型，以探討其在醫院感染研究中的意義。
一、材料與方法
1.菌株來源：1998年2月～1999年4月住廣州市三所綜合性醫院患者，分別取自痰、血液、傷口分泌物、腹水等臨床標本，經分離鑒定確定為金黃色葡萄球菌，共85株。醫院感染72株，社區感染13株。由一個實驗室統一鑒定到種。所有菌株-70℃冰箱保存。
2.醫院感染診斷標準：參照衛生部醫政司醫院感染監控協調小組製定的診斷標準。
3.工具酶及主要試劑：蛋白酶K、Taq DNA聚合酶及dNTPs均購自上海生物試劑公司。
4.DNA提取：500 μl LB液體培養基增菌，加入25 μl蛋白酶K，10%SDS10 μl 37℃溫育1小時。酚、氯仿、異戊醇抽提，無水乙醇沉澱，溶解於50μl雙蒸水中，低溫保存。
5.引物：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′由中國科學院上海生物工程有限公司合成。
6.聚合酶鏈反應(PCR)條件：反應體積為50 μl，含引物2.0 μmml/L，4種dNTP各125μmml/L，鎂離子濃度3.5 μmml/L，待測模板1 μl，Taq聚合酶1 U。PCR反應條件：92℃1 min，25℃ 2 min，65℃ 1 min，共35個循環，擴增產物在70 mV電壓，2 h，2%的瓊脂糖凝膠電泳，透射紫外儀下照相觀察。
二、結果
RAPD分型結果：可擴增出1～8帶，共分為37個基因型。3株未分型。
三、討論
應用隨機引物PCR進行指紋圖譜分析，相同引物，反應控製的條件(如退火溫度鎂離子濃度、模板濃度)不同，所得指紋圖譜亦不相同，進行PCR循環時退火溫度一般選擇在25～35℃，40℃以上時擴增效率逐漸減弱，另外鎂離子濃度對擴增也有影響，隨著鎂離子濃度的增加，長的擴增帶逐漸增多，短的擴增帶逐漸減少，一般認為鎂離子濃度在3.5～4.5 mmol/L時，長短片段均能得到良好的擴增［1，2］。與肖征等［3］報道相比，我們選擇了更低的退火溫度及穩定的鎂離子濃度，以確保RAPD的分辨率。該方法具有常規PCR技術的快速、安全、簡便、靈敏的特點，而且其引物是通用的，不必預先知道該物種的基因序列。在醫院感染研究部門中，應用相同的引物，可用於不同細菌的快速流行病調查，尤其是暴發流行的調查，為及時控製感染爭取了時間，所以，該技術為醫院感染分子流行病學研究提供了切實可行的研究方法。
本研究分型結果提示，三所醫院之間基因型差別較大，且同一醫院醫院感染株與社區感染株基因型完全不同。說明在同一醫院內菌株存在著流行趨勢，A醫院社區感染株基因型相近但不相同，可能與來就診患者相對集中在該社區有關。另外B醫院與C醫院無論是醫院感染株，還是社區感染株基因型均存在相同或相近，從地理位置上而言，這兩所醫院距離相對較近(約2公裏)，離A醫院均較遠(10公裏)。進一步說明了菌株流行趨勢，不僅與是否為醫院感染株有關，與地理位置亦有關。國內學者賀學英等［4］應用脈衝場電泳分型對金黃色葡萄球菌的研究認為醫院感染株為小流行，社區感染株為散發，與本文觀點不完全相同。
從1998年1月初～11月底，A醫院神經外科13例不同時期住院的患者不同部位的分離株，分別有6株和7株分為兩個基因型，說明這些菌株是同源的，同一病區存在著交叉感染，同一病區可有不同的基因型流行，同一菌株可以長期流行。英國報道［5］在一所醫院的重症監護病房病區6個月分離出17株耐甲氧苯西林金黃色葡萄球菌，其中1株來自護理員的手，16株來自患者，16/17株具有相同基因型，說明護理員的手可能是造成傳播的感染源。有文獻報道［6］呼吸道及鼻腔攜帶往往是其重要的感染源，通過健康工作人員手及空氣傳播造成感染，而且這種感染方式往往是造成暴發流行的主要原因。嚴格洗手、操作時戴口罩、加強消毒隔離措施是控製金黃色葡萄球菌交叉感染的根本措施。
基金項目：廣東省衛生廳科研項目資助(A980124)；廣東現代醫院管理研究所科研基金資助
參考文獻
1 Welsh JG, Meclellang M. Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Res, 1990,18：7213-7238.
2 Williams J, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphism′s amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res, 1990,18：6531-6535.
3 肖征，吳堅，楊繼勇，等.重複片段引物聚合酶鏈反應應用於醫院感染流行病學研究.中華醫學檢驗雜誌，1999，22：232-234.
4 賀學英，周惠平.PFGE方法在醫院感染病原學監測中的應用.中華醫院感染學雜誌，1998，8：75-77.
5 Tambic A, Power EG, Analysis of an outbreak of non-phage-Typeable methicillin-resistant Staphylococcus aureus by using a randomly amplified polymorph DNA assay. J Clin Microbiol, 1997,35：3092-3097.
6 Pujol M, Prna C, Pallares R, et al. Nosocomial staphylococcus aureus among nasal carriers of mrthcillon resistant and methcillin srscwptibic strains. an J Med, 1996,100：509-513.
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