16S-23S rRNA基因是位於16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的區間序列，具有較好的保守性和相對的可變性，被認為是細菌鑒定的合適部位［1，2］。我們認為能否快速有效地擴增該區間，聚合酶鏈反應(PCR)擴增前的標本處理是關鍵。故比較了3種裂解細菌的方法。
一、材料與方法
1.菌株、人類基因組DNA及病毒株來源：革蘭陽性6個菌種，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革蘭陰性21個菌種，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、綠膿假單胞菌等共40株。以上菌株由浙江省臨床檢驗中心及結核病防治中心提供，保存於我院細菌室。人類基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒由本院中心實驗室提供。
2.臨床標本：1999年6月～2000年3月本院新生兒住院患兒，部分為普通病房住院患兒。敗血症血標本42份，腦脊液標本6份。對照組15份，為本院新生兒病房非感染患兒康複期待出院者的血標本。
3.16S-23S rRNA基因區間序列引物設計：在細菌的16S rRNA基因的3′端及23S rRNA基因的5′端的保守序列內，經計算機軟件查閱自行設計引物。
4.臨床標本處理：血標本：0.5 ml的肝素抗凝血置室溫約10 min以沉澱血細胞，在血清與血細胞的交界麵（即白細胞層）吸取200 μl，注入1.5 ml滅菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl 1 ml，搖勻，放入
腦脊液標本：0.5 ml～1 ml腦脊液1 000 r/min離心1 min，去上清液，在沉澱物中加5% Chelex 100緩衝液200 μl和蛋白酶K 2 μl，
二、結果
1.Chelex 100改良裂解法能裂解所研究的所有菌種，且擴增產物條帶清晰，效果滿意。用經典的酚氯仿抽提法擴增細菌，效果同Chelex 100改良法，但步驟繁瑣［3］。
2.臨床標本的裂解：42例新生兒敗血症血培養15例陽性，血標本經改良Chelex 100裂解，PCR擴增後27例陽性，其陽性率明顯高於血培養，差異有顯著性意義（P＜0.01）。血培養陽性的15例PCR檢測均陽性，且檢測結果與血培養一致。另1組單純用水煮裂解，隻有5份陽性。6份腦脊液培養2例陽性，腦脊液PCR檢測4例陽性，培養陽性的2例與PCR結果相符。15份對照組血標本血培養及PCR檢測均陰性。
3.敏感性及引物特異性試驗：取潘尼變形杆菌標準菌株放入1 ml的dd H2O中，用麥氏比濁法確定起始濃度為108 CFU ，用dd H2O 1∶10定量稀釋，濃度範圍為2.5×104～2.5×10-3CFU，取2 μl模板在50 μl的PCR體係中擴增，檢測擴增下限。Chelex 100緩衝液裂解法得PCR的最小檢出量為2.5 CFU/ml。本對引物隻能擴增細菌，與人基因組DNA、新型隱球菌、巨細胞病毒無交叉反應，說明本對引物擴增細菌16s-23srRNA基因有較好的特異性。
三、討論
本研究首次在Chelex 100的基礎上進行改良，加上其他一些試劑配成一種適合不同菌種（包括葡萄球菌在內）PCR擴增的裂解液。並發現用Chelex 100改良法裂解細菌後所擴增的條帶較明亮清晰，效果滿意，可檢測2.5 CFU/ml的細菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用經典的酚/氯仿抽提細菌DNA再行PCR擴增，效果與Chelex 100改良法相同。但經典的方法步驟較繁瑣，DNA經常從1管轉移到另1管，且還要使用多種試劑，這都增加了PCR汙染的可能性。故Chelex 100改良裂解法是一簡便有效的方法，適合於不同菌株的擴增。
總之，經標準菌株和臨床標本的初步應用，證明本研究建立的用Chelex100 改良法一步擴增細菌的16S-23S rRNA基因區間具有準確、敏感、簡便、快速的特點，若經大量臨床標本的進一步證實，可成為一理想的診斷技術。
基金項目：浙江省自然基金資助項目(398426)
參考文獻
1，Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.
2，傅君芬，洪文瀾.16S-23S rRNA 區間序列——一種分型及鑒別細菌的新方法《國外醫學》流行病. 傳染病分冊,1998,25：245-249.
3，尚世強 ，洪文瀾 ，俞惠民，等. 細菌DNA的聚合酶鏈反應擴增及反相雜交初步分型. 中華醫學檢驗雜誌 ,1998,21：281-284.
