【摘要】 目的對白蘚資源進行種質保存，滿足人們栽培對種苗的需求。方法以白蘚嫩莖為材料，以植物組織培養方法為手段，進行了愈傷組織誘導，愈傷組織和不頂芽分化，試管苗生根，試管苗移栽、扡插和移植的研究。結果1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1為嫩莖愈傷組織的誘導培養和繼代培養的理想培養基；MS+AgNO31.5mg•L-1+BA0.8mg•L-1+naa0.2mg•L-1是嫩莖愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基；1/3MS+IAA0.4～0.6mg•L-1是生根培養和試管苗生根繼代培養的理想培養基；移栽的試管苗保持了野生白蘚的所有生物學性狀，成功地建立起白蘚的無性係。結論嫩芽誘導的愈傷組織建立的無性係能對其進行種質保存，所繁殖的種苗能滿足人們栽培的需求。
【關鍵詞】 白蘚； 愈傷組織； 無性係； 快速繁殖
白蘚Dictamnus dasycarpus，又稱八股牛，屬於芸香科白蘚屬多年生草本植物，生長於山坡、林下、林緣和草地。在我國的東北、華北、西北和華東等地有分布，朝鮮、蒙古和俄羅斯也有分布［1～3］。白鮮葉可提取芳香油；根莖作農藥用，可防治多種病蟲害；根皮（白蘚皮）入藥，具有解毒、祛熱、利尿、除濕和殺蟲等功效，能治皮膚瘙癢、濕疹、黃水瘡、黃疸、肝炎和陰部瘙癢等疾病［3～5］。由於白蘚既可作無公害的農藥，又是治療多種疾病的中藥，從而出現了人們大量采收，數量越來越少的現象。於是，遼寧南部地區有人試圖對其進行栽培，但由於人們長期地過量采挖，已經難以收集到種子，隻能將有限的野生植株挖回來作為種苗，這又使數量非常少的野生白蘚資源遭到了破壞。於是，我們對白蘚進行了組織培養及無性係建立的研究，以期滿足人們栽培對種苗的需求。雖然已多有芸香科植物組織培養研究的報道［6～9］，但迄今未見白蘚組織培養及無性係建立的研究的報道。本研究以白蘚的嫩莖為材料，成功地誘導形成愈傷組織，建立起無性係。
1 材料
1.1 材料及滅菌五月上旬至中旬，將林緣草地上長勢非常旺盛的白蘚嫩莖切下後，放到500 ml的磨口廣口瓶中，用自來水振蕩洗滌30 min左右，再用0.05 %安利洗滌液振蕩洗滌20 min左右，然後移到超淨工作台上，用70%～75%的乙醇滅菌約15 s後，迅速用無菌水振蕩洗滌2次，倒入0.05 % HgCl2 溶液振蕩滅菌3 min，接著用0.025 % HgCl2 溶液振蕩滅菌8 min，再用無菌水振蕩洗滌6次漓幹後，將裝有材料的瓶子置於27℃的溫箱中放置24 h，然後再用0.025%HgCl2滅菌6 min，接著用無菌水洗滌6次。即可獲得白蘚無菌嫩莖。
1.2 培養條件以MS，1/2MS，1/3MS為基本培養基，附加不同種類不同濃度的BA，IBA，IAA，NAA和2,4-D。以MS為基本培養基加蔗糖30 g•L-1，以1/2MS為基本培養基加蔗糖15 g•L-1，以1/3MS為基本培養基加蔗糖10g•L-1。培養基腖力強度為180 g/cm2［10］，pH為5.8～6.0，培養溫度20～25℃，光照度3 000 Lx左右，光照10～12 h•d-1。
2 方法
2.1 不同培養基對愈傷組織的誘導的影響
將無菌嫩莖用解剖刀切成長約0.2 cm的無生長點莖段，接種到附加不同濃度BA、IBA、NAA的1/2MS培養基上，進行愈傷組織的誘導培養。培養到50d時觀察統計培養結果。嫩莖愈傷組織的誘導試驗重複了3次，每次試驗繼代培養5代。
2.2 不同激素愈傷組織分化的影響
將繼代培養45 d生長一致的愈傷組織顆粒分散成獨立的顆粒後，接種到以MS+ AgNO31.5 mg•L-1為基本培養基，附加不同濃度BA、2,4-D或NAA的培養基中，進行愈傷組織的分化培養。每種培養基接種100個愈傷組織顆粒，統計觀察分化率和分化不定芽的生長狀況。
2.3 不同濃度IAA對不定芽生根的影響
把上述繼代培養的叢生狀、生長旺盛、高0.5 cm以上的不定芽從基部剪下，接種到以1/3MS為基本培養基，附加濃度分別為0.2，0.4，0.6 ，0.8，1.0 ，1.2 mg•L-1和1.4 mg•L-1的IAA培養基上，進行不定芽的生根培養。生根實驗重複了3次，每次試驗接種200個不定芽。
2.4 試管苗的移栽、扡插把繼代培養的生根試管苗培養瓶移到日光溫室中，除掉培養瓶瓶塞，在4000～7000Lx光照下煉苗4 d，用鑷子將試管苗取出，在清水中洗去根部培養基後，移栽到上麵分別鋪著一層厚為6～7 cm的河沙、珍珠岩、山皮土、園土、爐灰渣（小顆粒狀）5種移栽基質、下麵為肥沃園土的溫室苗床上。移栽後前15 d保持相對濕度為95％左右、溫度20～28℃、沒有直射光的條件。
把經過上述煉苗4 d的試管苗取出後，剪成長2cm左右，至少具有兩個腋芽或一個頂芽和兩個腋芽的莖段後，將最下麵的一個葉片剪掉後，把下部切口在濃度為90 mg•L-1的IAA溶液中浸泡處理4～6 min後取出，直接扡插到上麵覆蓋著一層上述五種事先已經澆透水的移栽基質的苗床上，並采用與移栽相同的條件進行管理。
3 結果
3.1 不同培養基對愈傷組織的誘導的影響由表1可見，接種到附加不同濃度BA、IBA的培養基中不能誘導形成愈傷組織；接種到附加不同濃度BA、NAA的培養基上都能誘導形成愈傷組織。但從愈傷組織的誘導率和長勢看兩個方麵看，以8、9號兩種培養基的誘導效果好。在這兩種培養基上培養的材料，不僅誘導率達100％，而且愈傷組織長勢好。觀察還表明，接種在這兩種培養基上的外植體，培養到10 d時，大部分培養材料在切口部開始出現愈傷組織，隨後愈傷組織開始迅速生長。初期形成的愈傷組織為無色、光滑的半透明狀，後來逐漸生長變化成為直徑在0.1cm左右的綠色顆粒狀。
把上述兩種培養基上由嫩莖誘導培養的、生長狀態一致的綠色顆粒狀愈傷組織分散為獨立的顆粒後，接種到相同的培養基上進行愈傷組織的繼代增殖培養。在相同的培養條件下培養45 d。經過3次重複試驗，每次重複試驗繼代培養5代的研究證明：初期培養的愈傷組織為淺綠色顆粒，後來伴隨著顆粒狀愈傷組織的迅速生長增殖，逐漸變成為綠色的顆粒。培養45 d的增殖係數為28.5。上述試驗結果說明，1/2MS+BA0.5 mg•L-1+NAA1.0～1.5 mg•L-1的培養基為白蘚嫩莖顆粒狀愈傷組織的誘導培養和繼代培養的理想培養基。表1 不同培養基對愈傷組織誘導的影響（略）
3.2 不同激素對愈傷組織分化的影響由表2可以看出，在不同濃度的BA與不同濃度NAA配合使用的培養基上，顆粒狀愈傷組織的分化情況較好，尤其是濃度為0.8 mg•L-1的BA與濃度為0.2 mg•L-1的NAA培養基上，不僅愈傷組織的分化率達到了98%，而且分化不定芽長勢好。試驗過程中的觀察還發現，在這一培養基上分化培養10 d左右愈傷組織顆粒即可分化出可見的淺綠色芽點，隨後，伴隨著愈傷組織顆粒的不斷分化增加和分化不定芽的生長，先分化的不定芽基部又會分化出數量不等的不定芽，形成了綠色的叢生不定芽。分化培養到45 d時，每個愈傷組織顆粒就會分化形成為有3～9個不定芽組成的叢生不定芽。
把上述分化培養的綠色不定芽從基部剪下，接種到相同的培養基上進行不定芽的分化培養。經過3次重複試驗，每次重複試驗繼代5代的研究證明：不定芽經過40 d培養，平均每個培養的不定芽可再分化生長出高0.5 cm以上不定芽5.4個。觀察還表明，經過40 d的培養，所培養的不定芽都分化生長為叢生狀，並且分化的不定芽葉片伸展、莖較粗壯、生長旺盛。
上述說明，MS+ AgNO31.5 mg•L-1+BA0.8 mg•L-1+NAA0.2 mg•L-1這一培養基是白蘚嫩莖顆粒狀愈傷組織和不定芽分化培養的理想培養基。表2 不同激素愈傷組織分化的影響（略）
3.3 不同濃度IAA對不定芽生根的影響試驗觀察表明，不定芽接種培養8 d時，有的培養基上開始出現根原基。培養到25 d時觀察統計的3次重複試驗的平均結果證明：在附加濃度為0.4 mg•L-1，0.6 mg•L-1的IAA培養基上，不僅平均生根率達到了96.5%和97%，平均每株生根數為6.1條，而且生根試管苗長勢旺盛。觀察還表明，不定芽接種到上述兩種培養基上10 d時，培養材料幾乎都形成了根原基，隨後伴隨著根的伸長生長，試管苗也迅速生長。培養到25d時，就可以生長成為高4～5 cm左右、葉片伸展、莖粗壯、根係發達的旺盛試管苗。把生根試管苗剪成長1cm左右、至少具有兩個腋芽或頂芽的莖段，接種到相同的培養基上進行生根繼代培養。經過25 d的培養，又可以培養成1代旺盛的試管苗。經過3次重複試驗，每次重複實驗6代的繼代培養研究證明，用這種生根繼代培養的方法進行繁殖，不僅培養材料的生根率近100%、25 d的繁殖係數為3.1，而且幾乎沒有無效苗，繁殖試管苗生長非常旺盛。上述結果說明，1/3MS+IAA 0.4～0.6 mg•L-1這一培養基是白鮮不定芽生根培養和試管苗生根繼代培養的理想培養基。
3.4 試管苗的移栽、扡插和移植移栽後10 d可見成活生長，25 d時觀察統計證明，以河沙和爐灰渣為移栽基質平均成活率分別為95%，97.4%，移栽成活後15 d左右開始正常生長。
扡插後15 d可見成活生長，30 d時觀察統計證明，以爐灰渣為扡插基質，成活率為91%。扡插苗前50 d植株較小，後期長勢與移栽苗一致。上述說明，爐灰渣是白鮮試管苗移栽和扡插的理想基質。
把在日光溫室中移栽、扡插成活的試管苗於五月中旬和下旬先後兩次移植到山坡上，移植的白蘚試管苗保持了野生白蘚的所有生物學性狀，但與當年的白蘚實生苗相比，試管苗移植後的前70d生長較慢、植株較小，後期葉色濃綠、生長非常旺盛而整齊，根係發達（相當於實生苗的1.5～2倍），移植苗當年可正常開花結實。
4 討論
本研究以無生長點嫩莖為材料建立起白蘚的無性係。這說明白蘚的非分生細胞和組織也具有全能性。
用愈傷組織的繼代培養的方法進行繁殖，45 d的增殖係數為28.5。按照這個速度計算，每年的繁殖數量為28.58個；用不定芽分化繼代的方法進行繁殖，平均40 d能培養5.4個不定芽。按照這個速度計算，每年的繁殖數量為5.49個；用生根繼代的方法進行繁殖，25 d的繁殖係數為3.1。按照這個速度計算，每年的繁殖數量為3.114.6個。上述計算結果證明：無論采用上述哪種方法進行繁殖，每年都能繁殖出大量的試管苗，滿足人們生產對大量種苗的需要，但由於采用生根繼代的方法繁殖的試管苗生長旺盛、沒有無效苗。所以，生產上應采用生根繼代的方法繁殖白蘚試管苗。
現在許多研究指出，通過繼代培養的愈傷組織分化的試管苗容易發生變異［11～12］，但在本研究中由白蘚無生長點嫩莖愈傷組織誘導培養的的試管苗不僅保持了白蘚的所有生物性狀，並且試管苗長勢旺盛而整齊。這可能是由以下原因引起的：一是本研究的環境較為穩定，不易使培養材料發生變異；二是白蘚本身具有穩定的遺傳性，不易受到培養環境的影響發生變異。這說明通過白蘚嫩莖誘導的愈傷組織建立的無性係能夠對其進行種質保存。
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