論文摘要:植物組織培養過程中，褐變問題普遍存在,與菌類汙染和玻璃話現象並稱為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題，本文結合相關資料，對影響褐變的因素作了全麵分析，褐變的影響因素是複雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內因外界影響作用作了分析並針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑製作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防範措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表麵培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關係。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態被打破，酚類化合物外溢。對於外植體本身來講，酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶係統失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由於組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2 褐變產生的機理
2.1 非酶促褐變
非酶促褐變是由於細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，並不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2 酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、芸香苷等），但並非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在並不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由於多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一係列的脫水、聚合反應，最後形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3 褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是複雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類及基因型 不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
3.2 外植體部位及生理狀態 外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3 培養基成分 培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關係。
3.4 培養條件 溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4 防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑製:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑製有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
4.1 適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周後長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2 對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水衝洗後，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然後接種於隻含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鍾，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天後再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合後，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑製。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
4.3 適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
4.3.1 適當的無機鹽濃度 張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半) 和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
4.3.2 適當和適量的激素 王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1 mg/L BA + 0.5mg/L 2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/L BA+1mg/L 2,4-D 時，愈傷組織淺黃疏鬆，增殖也快。
4.3.3 培養基的硬度 在一定範圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
4.3.4 培養基中水的硬度的影響 硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配製培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5 培養基的pH值 在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0 時MS液體培養基可保持愈傷組織處於良好的生長狀態，其表麵呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利於褐變過程的發生[10]。
4.3.6 培養條件 如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜係統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
4.4 添加褐變抑製劑和吸附劑
褐變抑製劑主要包括抗氧化劑和PPO抑製劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由於其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限製。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 +結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑製多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等, 從而有利於培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負麵影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化製備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用於防止褐變[15]。
4.5 進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天後應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑製作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
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