摘 要 目的：闡明波動條件下細菌自身代謝與周圍環境變化的關係。方法：通過Lowry法檢測蛋白質含量，鄰甲苯胺法檢測葡萄糖含量，聚鄰苯二胺pH修飾電極檢測pH值來觀察環境條件的變化；以顯色法檢測波動環境內、外細菌的TTC-脫氫酶活性。結果：細菌群體在靠近中央位置形成封閉環境，在遠離中央位置出現濃度梯度現象。伴隨著封閉環境的形成，細菌代謝近乎停止；伴隨著濃度梯度的出現，細菌代謝趨於旺盛。結論：細菌的波狀生長是生物耗散與生態環境相統一的具體表現。
關鍵詞：波動生長；細菌代謝；環境變化
細菌的生長代謝是開放係統條件下的生命活動過程，它一方麵導致著周圍環境條件的變化，另一方麵又受到環境條件變化的製約。許多學者把環境因素納入了微生物學研究的範疇，運用環境條件變化與細菌生長代謝改變的關係來預測菌群間相互作用的結果［1］、食品中細菌的生長狀況［2］並建立預測模型［3］。不同環境條件下細菌的生長方式及生理狀態都有所不同，這在細菌生長的群體、周期和波動變化中可得以體現［4］。目前，對細菌波動生長過程的研究主要集中在對細自身變化的探討上，對環境因素變化與細菌自身變化的關係研究得較少。研究細菌波動過程中環境因素的菌變化及細菌代謝活性的變化，有助於對細菌波動發生機製的解釋。
本實驗以變形杆菌波動模型為研究對象，定量檢測了波動模型形成過程中不同波動環中的營養物質含量，酸堿堆積情況及細菌代謝活性，以期為細菌波動的發生機製提供環境因素及細菌代謝方麵的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 菌種
奇異變形杆菌(P.mirabilis)，由生物波研究中心保存。
1.2 波動培養基
按照劉俊康等［5］報道的方法製備。
1.3 聚鄰苯二胺pH修飾電極
由本校化學教研室提供。
1.4 細菌波動生長過程中各環蛋白質及葡萄糖含量的測定
每次用5塊波動Ⅰ號平板，重複4次。每塊平板中心點種奇異變形杆菌，
1.5 細菌波動生長過程中不同區域pH值測定
同上法波動培養24h後，自中心環向外，每環取3點，用聚鄰苯二胺pH修飾電極測定各環的pH。
1.6 TTC-脫氫酶標準曲線的製作
按牛誌卿等［6］提供的方法，用直線回歸方程表示。
1.7 細菌波動過程中各環TTC-脫氫酶活性的測定
同上法波動培養24h後，每環取定量細菌振蕩混勻於5ml蒸餾水中，然後用5ml三氯甲烷進行萃取，其餘步驟同標準曲線製作。
1.8 各環細菌波動環境外的TTC-脫氫酶活性測定
用未加氯化三苯基四氮唑(TTC)的波動Ⅰ號培養基同上法波動培養24h後，每環取定量細菌配成1ml菌液，各加入Tris-HCl緩衝液2ml和TTC-葡萄糖標準溶液2ml，置於(37±1)°C恒溫培養箱中，反應4h顯色後，其餘步驟同標準曲線製作。
1.9 統計學處理
實驗數據均以
2 結果
2.1 細菌波動生長過程中各環蛋白質含量、葡萄糖含量、pH值及兩兩間差異的檢驗
結果見表1，波動的前6環之間數值比較接近，後4環出現較大變化，經Newman-Keuls法對各組數據進行了多重比較，結果顯示，在α=0.05水平下，蛋白質含量、葡萄糖含量及pH值在細菌波動的前6環之間差異均不顯著，在後4環之間及後4環與前6環之間差異均顯著。
表1 各波動環中蛋白質、葡萄糖含量及pH值(
tab1 Protein,glucose content and pH of different bacterial wave loop(
|
|
Bacterial wave loop | |||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 | |
|
Protein(ρB/g．L-1) |
3.990±0.025 |
3.884±0.018 |
3.972±0.017 |
3.932±0.052 |
3.926±0.058 |
4.002±0.017 |
5.024±0.058 |
6.372±0.017 |
7.828±0.067 |
8.968±0.037 |
|
Glucose(ρB/g．L-1) |
0.226±0.008 |
0.248±0.002 |
0.238±0.002 |
0.254±0.004 |
0.254±0.001 |
0.364±0.001 |
0.470±0.003 |
0.588±0.007 |
0.754±0.001 |
0.863±0.004 |
|
pH |
8.580±0.007 |
8.0640±0.003 |
8.610±0.013 |
8.440±0.008 |
8.460±0.003 |
8.520±0.002 |
8.260±0.003 |
7.940±0.003 |
7.660±0.003 |
7.440±0.003 |
2.2 細菌波動過程中各細菌環的TTC-脫氫酶活性
結果見表2。經Newman-Keuls法對同一環不同時間TTC-脫氫酶催化反應的TTC量進行兩兩間比較，結果顯示，在α=0.05的水平下，前6環在不同時間的TTC消耗量差異不顯著，後4環在不同時間的TTC消耗量差異顯著。 表2 不同波動環中的細菌TTC-脫氫酶活性(mg,
tab2 Bacterial TTC-dehyogenase activity in different wave loop(mg,
|
|
The reduction quantiy of TTC in different bacterial wave loop | |||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 | |
|
1 h |
0.0406±0.0013 |
0.228±0.0047 |
0.0438±0.0017 |
0.0210±0.0035 |
0.0454±0.0048 |
0.0232±0.0037 |
0.0381±0.0025 |
0.017±0.0016 |
0.0394±0.0013 |
0.0156±0.0013 |
|
2 h |
0.0414±0.0016 |
0.0232±0.0028 |
0.0426±0.0024 |
0.0231±0.0019 |
0.0466±0.0027 |
0.0228±0.0022 |
0.0408±0.0034* |
0.0204±0.0023* |
0.0412±0.0007* |
0.0173±0.0024* |
|
3 h |
0.0409±0.0032 |
0.0229±0.0016 |
0.0431±0.0017 |
0.0224±0.0022 |
0.0457±0.0043 |
0.0234±0.0025 |
0.0433±0.0021*△ |
0.0226±0.0018*△ |
0.0442±0.0027*△ |
0.0212±0.0032*△ |
2.3 波動環境外各環細菌的TTC-脫氫酶活性
結果見表3。用Newman-Keuls法對數據進行了兩兩比較，在α=0.05的水平下，兩兩間差異均不顯著。
表3 波動環境外各環細菌的TTC-脫氫酶活性(mg,
tab3 Bacterial TTC-dehyogenase activity in different wave loop outside of the wave environment(mg,
|
Bacterial wave loop |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
Reduction quantity of TTC |
0.0388±0.0017 |
0.0368±0.0025 |
0.0374±0.0008 |
0.0390±0.0018 |
0.0374±0.0017 |
0.0364±0.0020 |
0.0404±0.0020 |
0.0380±0.0010 |
0.4000±0.0009 |
0.0360±0.0010 |
3 討論 細菌的生命活動在不同的環境條件下發生潛-生序適應性變化，宏觀上表現為不同的生長方式，Rascle等［7］建立了細菌的趨化性生長模型，徐啟旺等［4］也建立了細菌波動生長模型並揭示出細菌的波狀生長方式可能是一種普遍現象。實驗研究已經發現細菌在波狀生長過程中會發生短杆菌與長條菌之間的潛-生序交替變化，兩者在細胞結構及抵抗力方麵存在著一些差別［8］，這些都初步提示細菌在潛-生序微觀變化基礎上產生的宏觀波動可能是細菌的一種自我保護和生存機製，本實驗選取培養基中蛋白質和葡萄糖含量作為衡量環境營養狀況的指標，以pH值作為衡量環境酸堿堆積情況的指標，通過測定細菌的TTC-脫氫酶活性來反映細菌的代謝活性，將這些指標相結合，有助於精細分析周圍環境壓力與細菌自身變化間的相互作用。
表1的實驗結果顯示，隨著細菌由中心向外波動的延伸，培養基中營養物質的消耗情況和酸堿物質的堆積情況在前6環中基本上是形成了一個平台，在最後4環中才逐漸形成了一個減少或增加的梯度。經單因素方差分析結果顯示，前6環中各環之間營養物質含量及環境pH值差異不顯著，後4環之間的差異及各環與標準對照之間的差異均顯著(P＜0.05)。從實驗結果中可看出，前6環中營養物質含量甚少，且相互間無顯著差異，表明這6環中已幾乎形成了一個封閉環境，如果將這個封閉環境中的所有細菌都移去，細菌波動仍然能夠繼續延伸，這表明封閉環境內由於營養物質的耗散，細菌生命活動極度減弱，對細菌波動的延續已不起主導作用；而後4環中環境的營養物質還存在一定的梯度，即還存在著一個非平衡環境，因此當封閉環境中的細菌移去後，由於非平衡動力的存在，細菌波動仍然能夠延續下去。
為了進一步觀察封閉環境及非平衡環境對細菌生命活動的影響，我們還測定了各環中細菌的TTC-脫氫酶活性及各環細菌移出各自的波動環境後的TTC-脫氫酶活性，從第9環(即第5個紅環)初步形成開始到第9環完全形成的3h中，每隔1h測定一次各環細菌的TTC-脫氫酶活性，結果顯示第5環以前的各環細菌TTC-脫氫酶活性幾乎沒變化，而第6環以後的細菌TTC-脫氫酶活性均逐漸有所增加。但我們把中心環直至最外環的細菌均定量取到試管中測定它們各自的TTC-脫氫酶活性時，結果則顯示各環間相差不顯著(P＞0.05)。這些都強烈地提示在細菌波動過程中，一旦形成了封閉環境，細菌生長便近乎停止，留下來的是生命活動的載體和殘跡，當進入一個開放係統後，波動又沿著單一方向進行下去。
細菌波動是生物波的一個簡單模型，本實驗結合一些先前研究結果從一個方麵提示，細菌波動過程是一個生物耗散與生態環境相統一的過程。而兩者的因果關係及細菌波動生長過程的調控機製，尚有待進一步的研究。
參考文獻
［1］Chapuis C,Flandrois J.Mathematical model of the interactions between Micrococcus spp.and Pseudomonas aeruginosa on agar surface［J］.J appl Bacteriol,1994,77(6):727－732.
［2］Baranyi J,Poberts T A.A dynamic approach to prediting bacte-rial growth in food［J］.Int J Food Microbiol,1994,23(3～ 4)： 277－294.
［3］Van Impe J F,Nicolai B M,Schellekens M,et al.Predictive microbiology in a dynamic environmental system theory approach ［J］.Int J Food microbiol,1995,25(3):237－249.
［4］徐啟旺，劉俊康，郭剛，等.微生物生長的群體、周期和波［J］.自然雜誌，1992，15(3)：195－196.
［5］劉俊康，郭剛，徐啟旺，等.生物波理論的研究［J］.中國微生態學雜誌，1994，6(6)：40－44.
［6］牛誌卿，劉建榮，吳國慶.TTC-脫氫酶活性測定法的改進［J］.微生物學通報，1994，21(1)：59－61.
［7］Rascle M,Ziti C.Finite time blow-up in some models of chemotaxis［J］.J math Biol,1995,33(4):388－414.
［8］郭剛，黃春基，王源，等.抗生素Sub-MIC誘導纖細菌與潛生體的比較研究［J］.中華流行病學雜誌，1996，17(3-C)：120－123.
上一篇：鑭、鈰對變形鏈球菌的直接抑菌作用
