利用重組分支杆菌噬菌體快速篩選耐利福平結核分支杆菌

　　關鍵詞：分支杆菌噬菌體；利福平；藥敏試驗；分支杆菌，結核

　　近年的監測發現結核病的發病率及死亡率在全球範圍內均有上升的趨勢，同時耐藥菌株的感染增加，給結核病的防治帶來了很大的困難。利福平(R)是最常用的一線抗結核藥，研究表明對利福平耐藥的分支杆菌常常對其它抗結核藥耐藥。由於常規結核分支杆菌檢測和藥物敏感試驗方法需6～12周，無法給臨床提供及時、準確的用藥參考，因此如何縮短藥物敏感試驗時間、提高檢測的敏感性和特異性，已引起國內外學者關注。我們采用兩株重組的可表達熒光素酶結核分支杆菌噬菌體，建立一種簡便、快速、靈敏的結核分支杆菌利福平藥敏試驗方法。

　　材料與方法

　　一、材料

　　卡介苗（BCG）購自衛生部上海生物製品研究所。結核分支杆菌H₃₇Ra（ATCC25177）和結核分支杆菌H₃₇Rv（ATCC36801）購自中國藥品生物製品檢定所。恥垢分支杆菌(M.smegmatis)（ATCC19420）和大腸杆菌（Escherichia coli）（ATCC25922）分別由同濟醫科大學分子生物學教研室和微生物學教研室提供。本實驗用分支杆菌噬菌體Phage40和Phage 88由Albert Einstein大學的William Jacobs 教授提供。

　　二、方法

　　1．細菌培養： BCG及緩慢生長分支杆菌在M7H9培養基中培養，恥垢分支杆菌等快速生長分支杆菌在Suton培養基中培養，大腸杆菌在普通瓊脂培養基中培養。細菌濃度采用722分光光度計測量，吸光度(A)=1時的細菌數約為2×10⁹個。同時用倒置顯微鏡進行微菌落計數。

　　2．分支杆菌噬菌體的增殖與分離：分支杆菌噬菌體在恥垢分支杆菌中增殖。噬菌體加入Suton培養液，繼續培養一段時間後終止培養，用賽氏漏鬥過濾（采用0.45μm濾膜），保存濾液。或用固體苦味酸培養基，在噬菌斑出現後用噬菌斑裂解液裂解後收集裂解液，0.45μm濾膜過濾，用氯化銫30 000 g進行梯度離心純化。

　　3.分支杆菌噬菌體的計數：將分支杆菌噬菌體濃縮液先進行一係列10倍梯度稀釋後加入在苦味酸培養基中生長的恥垢分支杆菌菌苔中，培養48 h觀察噬菌斑並計算噬斑形成單位數（PFU）。

　　4.發光分析：蟲熒光素（luciferin，德國BM公司，純度為99%）臨用前用Tris（pH 7.8）緩衝液配製成相應濃度。細菌離心後用M7H9培養液洗2次，然後重浮在原體積的培養液中，孵育過夜。1 ml菌液中加入10³ PFU/ml的分支杆菌噬菌體1 ml孵育24 h後，取100μl樣品於13 mm×75 mm的聚苯乙烯試管中，在最佳發光條件下（0.22 mmol/L熒光素 100 μl，0.1 mmol/L ATP 100 μl，檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液100μl），LKB-1251發光儀中測量30 h內發光值。

　　5.發光分析測定各種細菌的耐藥性：標準菌株及分離株采用Mcfarland3.0濁度（細菌濃度10⁷ CFU/ml），洗後重浮於2 ml培養液中，加入不含Tween80的含利福平及不含利福平M7H9培養基中37 ℃培養24 h，加入10³滴度的相應噬菌體孵育24 h後測量發光值。含利福平培養基的配製為在M7H9培養基中加入相應濃度的利福平組成，同時測定不同的利福平濃度梯度對臨床分離耐藥株及標準株的作用曲線。陰性對照采用標準藥敏株H₃₇Ra減毒株，陽性對照采用標準耐藥株H₃₇Rv強毒株。

　　6.測量和統計方法：每個因素做3管測發光值，每個值重複2次，每次發光測量測6 s的積分發光值。結果取均數±標準差表示，統計分析采用t檢驗。

　　結果

　　一、兩種噬菌體對不同細菌的發光分析

　　用兩種噬菌體分別對大腸杆菌、BCG、恥垢分支杆菌、結核分支杆菌菌株H₃₇Ra和H₃₇Rv進行了發光檢測，結果表明：兩株噬菌體對分支杆菌有特異性，非分支杆菌的大腸杆菌發光值很低，與陰性對照相比差異無顯著性（P＞0.05），各種分支杆菌的發光值均較高，與陰性對照相比差異均有顯著性（P＜0.05）。用Phage40檢測分支杆菌時，發光值均在加入發光液後逐步上升，4 h左右達到最高值，以後逐步下降，在15 h後發光基本消失，所有分支杆菌的發光動力學過程都基本相似，但發光值有所不同，其中BCG的發光值最高，最高值約為陰性對照的100倍；恥垢分支杆菌次之，最高值約為陰性對照的70倍；結核分支杆菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv的最高發光值約為陰性對照的25倍。用Phage 88檢測分支杆菌時，發光值均在加入發光液後13 h左右達到最高值，以後逐步下降，在30 h後發光基本消失，所有分支杆菌的發光動力學過程都基本相似，但發光值有所不同，其中BCG的發光值最高，約為陰性對照的200倍；恥垢分支杆菌次之，最高值約為陰性對照的150倍；結核分支杆菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv約為陰性對照的50倍。

　　二、進行藥敏試驗的利福平濃度篩選

　　為確定最佳的藥敏試驗濃度，采用係列梯度稀釋的利福平對藥敏株和耐藥株進行發光分析，結果發現藥敏株和耐藥株在含不同濃度利福平培養基中的發光反應明顯不同。Phage40在發光反應開始後4 h達到最高值，此時陽性對照H₃₇Rv為94.3 mV，耐藥株在利福平濃度0.5 μg/ml時為84.95 mV，1 μg/ml時為80.45 mV，2 μg/ml時為76.34 mV；藥敏株在0.5 μg/ml時為36.37 mV，1 μg/ml時為15.16 mV，2 μg/ml時為5.118 mV，與陰性對照H₃₇Ra相比（0.544 mV）差別小於10 mV。Phage88在發光反應開始後14 h達到最高值，此時陽性對照H₃₇Rv為271.3 mV，耐藥株在利福平濃度0.5 μg/ml時為250.4 mV，1 μg/ml時為241.5 mV，2 μg/ml時為234.1 mV；藥敏株在反應後12 h達到最高發光值，在利福平0.5μg/ml時為146.3 mV ，1 μg/ml時為80.34 mV，2 μg/ml時為5.033 mV，與陰性對照H₃₇Ra（0.537 mV）相比差別小於10 mV。可見耐藥株在含利福平培養基中的發光值與陽性對照比較，差異無顯著性（P＞0.05），而藥敏株的發光值則隨利福平濃度的升高而明顯降低，差異有顯著性（P＜0.001），在利福平2μg/ml濃度時藥敏株的發光值與陰性對照已無明顯區別（P＞0.05），而耐藥株的發光值未受顯著性影響。通過該係列藥物濃度的篩選試驗，得到最適於利福平藥敏試驗的濃度為2μg/ml。在該濃度下可通過發光值明顯區別藥敏株和耐藥株。

　　三、兩種噬菌體對不同分支杆菌的利福平藥敏試驗結果

　　為判定噬菌體生物發光技術對不同分支杆菌的藥敏試驗的可行性及確定最佳實驗條件，采用2μg/ml利福平濃度對不同的噬菌體和分支杆菌進行藥敏試驗，結果如下。

　　1.兩種噬菌體對標準株的利福平藥敏試驗：利福平濃度為2μg/ml，利用Phage 40對H₃₇Rv、H₃₇Ra、大腸杆菌和恥垢分支杆菌mc155進行藥敏試驗，以4 h的發光值為標準，僅H₃₇Rv的發光值與陰性對照差異有顯著性（P＜0.001），約為陰性對照的30倍，其他菌株的發光值均與陰性對照差異無顯著性（P＞0.05）。同時又用Phage88對H₃₇Rv、H₃₇Ra、大腸杆菌和恥垢分支杆菌mc155進行藥敏試驗，以12 h的發光值為標準，僅H₃₇Rv的發光值與陰性對照差異有顯著性（P＜0.001），約為陰性對照的60倍（P＜0.001），其他菌株的發光值均與陰性對照差異無顯著性（P＞0.05）。

　　2.兩種噬菌體對臨床耐單藥分離株的利福平藥敏試驗：利福平濃度為2μg/ml，用Phage 40對1株臨床分離的結核分支杆菌耐藥株和3株臨床分離的非耐藥結核分支杆菌株進行藥敏試驗，以4 h的發光值為判斷標準，僅1株臨床分離的結核分支杆菌耐藥株的發光值與陰性對照差異有顯著性（P＜0.001），約為陰性對照的20倍，3株臨床分離的非耐藥結核分支杆菌株的發光值均與陰性對照差異無顯著性（P＞0.05）；同時又用Phage88對上述菌株進行了藥敏試驗，以12 h的發光值為判斷標準，僅1株耐藥結核分支杆菌株的發光值與陰性對照差異有顯著性（P＜0.001），約為陰性對照的60倍，3株非耐藥結核分支杆菌株的發光值均與陰性對照差異無顯著性（P＞0.05）。表明噬菌體可區別利福平耐單藥株。Phage40的最高發光值在反應後4 h，Phage 88的最高發光值在反應開始後12 h。

　　3.兩種噬菌體對臨床分離耐多種藥物株的利福平藥敏試驗：對臨床分離的耐多種藥物株進行發光分析，結果發現在利福平濃度為2μg/ml時，各株的發光值分別為：Phage 40測定（反應後4 h）分離株1為73.45 mV、2為60.39 mV、3為79.46 mV、4為64.39 mV、5為4.927 mV、6為0.844 mV、陰性對照0.844 mV；Phage 88（反應後12 h）測定分離株1為265.5 mV、2為237.6 mV、3為260.4 mV、4為254.3 mV、5為5.467 mV、6為4.865 mV、陰性對照0.812 mV。可見分離株1、2、3、4為利福平耐藥株，5、6為利福平藥敏株。耐利福平的臨床分離株發光值與陰性對照比較差異有顯著性（P＜0.005），不耐利福平的耐多種藥物株的發光值均與陰性對照差異無顯著性（P＞0.05）。表明噬菌體可區分耐利福平的臨床耐多種藥物分離株。Phage40的最高發光值在反應後4 h，Phage 88的最高發光值在反應開始後12 h。

表1　羅氏培養基與噬菌體生物發光方法結果比較

　　注：^*兩種方法所需時間的比較均為P＜0.01；^**在各藥物培養基中的平均時間；Ⅰ為異煙肼，S為鏈黴素

　　4.噬菌體生物發光檢測結果與羅氏培養基的比較: 從表1可見對11株臨床分離株、2株噬菌體的生物發光技術檢測的結果與羅氏培養基相比，符合率為100%，藥敏試驗時間為72 h。噬菌體生物發光技術有很好的敏感性和特異性，並且可在72 h內得到準確的結果，是一種極有應用前景的技術。

　　討論

　　一、噬菌體生物發光技術可特異地用於分支杆菌的藥敏試驗

　　噬菌體生物發光技術對非分支杆菌如大腸杆菌的發光值很低，與陰性對照比較差異無顯著性（P＞0.05），而對各種分支杆菌的發光值卻較高，表明噬菌體對分支杆菌的特異性，也表明噬菌體生物發光技術的特異性。

　　在含利福平的培養基中，藥敏株與耐藥株的發光特性有明顯的區別。噬菌體對耐藥株的發光值在同等藥物濃度下比對藥敏株的發光值要高，表明抗結核藥利福平可抑製相應的藥敏株對熒光素酶的表達，而對耐藥株的熒光素酶表達無影響，利用該特性可對結核分支杆菌分離株進行藥敏試驗分析。研究表明這與抗結核藥直接或間接作用於細菌的轉錄和翻譯過程有關。在結核分支杆菌內增殖的噬菌體對熒光素酶的表達有賴於細菌的轉錄和翻譯過程，這兩個過程受抑製後，噬菌體的增殖和表達熒光素酶的能力受到影響，使發光反應降低。利福平作為殺菌藥，對細菌這兩個過程作用較強，對敏感株的發光值影響出現較早，表現為藥敏株的最高發光值比耐藥株的最高發光值提前。與國外的報道^［1-5］相似。

　　噬菌體生物發光技術在標準株和各臨床分離株的藥敏試驗均得到有統計意義的發光結果，得到藥敏試驗結果的時間僅72 h，大大低於羅氏培養基的藥敏試驗時間。因此生物發光技術用於結核分支杆菌的快速藥敏試驗有遠大的前景，在新抗結核藥的篩選上也有很大的用處。

　　二、利福平藥敏試驗時濃度的選擇

　　利福平藥敏試驗時的利福平濃度梯度在不同的培養基中各不相同，在液體培養基中的濃度大多集中在0.5～10μg/ml之間，在不同的實驗中也稍有不同^［2-8］。我們參考其它實驗結果，采用了係列利福平濃度梯度進行藥敏試驗比較，可見在利福平2μg/ml時藥敏株的發光值與陰性對照值無明顯差別，耐藥株的發光值不受影響，表明該係列濃度值適合於藥敏試驗，與Carriere等^［2］的結果相同。

　　三、兩株噬菌體在藥敏試驗中的結果差異

　　從實驗結果中可見在藥敏試驗中，兩株噬菌體的發光值有明顯差別，即溫敏株噬菌體Phage88對藥敏試驗的發光值和靈敏度均高於Phage 40，這也證明了溫敏株噬菌體的基因突變對噬菌體表達熒光素酶有一定的影響。Jacobs等^［1］認為Fflux插入的位點不同對Fflux的表達有一定的影響。Fflux插入的部位如在受體噬菌體的強順式作用元件作用範圍內，順式作用元件可控製重組噬菌體的操縱子的活性及其對Fflux表達的調控。他們還利用羥胺突變形成溫敏株噬菌體，並與原噬菌體對比，結果表明不同位點的突變對噬菌體突變株的裂解受體菌的能力和對Fflux的表達也有明顯不同的影響：噬菌體裂解受體菌的能力越弱，其表達Fflux的能力增強。這與Phage88發光值高但持續時間長有關^［1-4］。

　　四、對臨床分離株的診斷符合率高

　　通過對Mcfarland 3.0濁度（實際細菌濃度10⁷CFU/ml）的各臨床分離株進行利福平藥敏試驗結果顯示，耐藥株之間的發光值差別不大，但耐藥株與藥敏株的發光值有顯著性差異，表明采用噬菌體生物發光技術可敏感地區分臨床分離株中對利福平的藥敏株和耐藥株。對臨床分離株的診斷結果可見噬菌體生物發光法檢測結果與羅氏培養基相比符合率一致，而且僅用72 h即可得到藥敏試驗結果，快速、準確。對臨床分離株進行診斷和檢測均有很好的應用前景。

　　本實驗結果說明，用重組噬菌體可進行結核分支杆菌利福平藥敏情況的快速檢測，其結果與羅氏培養基結果一致，但時間明顯縮短，僅為3 d。尤其對耐利福平菌株的檢測和判斷具有很大的應用價值，值得推廣應用。

　　參考文獻

　　［1］Jacobs wR, Barletta RG, Udani R，et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages. Science,1993, 260: 819-822.

　　［2］Carriere C, Riska P, Zimhony O，et al. Conditional replicating luciferase reporter phages: improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin microbiol, 1997, 35: 3232-3239.

　　［3］Riska PF, Jacobs WR, Bloom BR，et al. Specific identification of mycobacterium tuberculosis with the luciferase reporter Mycobacteriophage: use of p-nitro-acetylamino-β-hydrocxy propiophenone. J Clin Microbiol, 1997, 35:3225-3231.

　　［4］Riska PF, Su Y, Bardarov S，et al. Rapid film-based determination of antibiotic susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis strains by using a luciferase reporter phage and bronx box. J Clin Microbiol, 1999, 37: 1144-1149.

　　［5］Cooksey RC, Crawford JT, Jacons WR，et al. A rapid method for screening antimicrobial agents for activities against a strain of Mycobacterium tuberculosis expressing firefly luciferase. Antimicrob Agents Chemother, 1993,37：1348-1352.

　　［6］Nilsson LE, Hoffner SE, Ansehn S. Rapid susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis by bioluminescence assay of mycobacterial ATP. antimicrob Agents Chemother, 1988, 32:1208-1212.

　　［7］Beckers B, Lang HR, Schimke D, et al. Evaluation of a bioluminescence assay for rapid antimicrobial susceptibility testing of mycobacteria. Eur J Clin microbiol, 1985 , 4: 556-561.

　　［8］Limb DI, Wheat PF, Spencer RC, et al. Comparison of techniques for antimicrobial susceptibility testing of mycobacteria. J Clin Pathol, 1993, 46:403-407.

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