【摘要】目的檢測與分析細胞壁缺陷結核分枝杆菌的耐藥性相關基因，探討細胞壁缺陷結核分枝杆菌耐藥性的基因基礎。方法分別分離16株自發形成和用利福平、異煙肼、乙胺丁醇誘導形成的結核分枝杆菌的染色體DNA，PCR擴增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因後進行凝膠電泳和序列分析。結果自發形成及抗結核藥物誘導形成的結核分枝杆菌穩定L型可在含利福平、異煙肼、乙胺丁醇的培養基內生長與傳代培養。基因檢測與分析顯示，結核分枝杆菌穩定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未見突變。結論結核分枝杆菌穩定L型可自發形成，也可被利福平、異煙肼和乙胺丁醇誘導形成。結核分枝杆菌穩定L型對利福平、異煙肼、乙胺丁醇形成耐藥性，但其染色體上耐藥相關基因並沒有發生突變。除染色體耐藥相關基因突變可造成結核分枝杆菌形成耐藥性外，細胞壁缺陷也是造成結核分枝杆菌形成耐藥性的一個重要機製。
【關鍵詞】 結核分枝杆菌；細胞壁；基因；耐藥性
ABSTRACT Objective To determine and analyze the genes related to drug resistance， and probe the properties of drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis. Methods The sequence of IS986 and the genes of rpoB， katG and embB were isolated respectively from the L-forms derived spontaneously and induced by rifampin， isoniazid and ethambutol respectively from 16 strains of M.tuberculosis， and then the genes were determined by agarose gel electrophoresis and analyzed by direct sequencing. Results The both of L-forms derived spontaneously and induced from M.tuberculosis were grow well and be subcultured in the non-high osmotic liquid media with rifampin ， isoniazidand ethambutolrespectively. The sequence of IS986 and the genes of rpoB， katG and embB were held in the stable L-forms and no gene mutation was found in them. Conclusion The L-forms were formed spontaneously or induced by rifampin， isoniazid and ethambutol. The L-forms derived either spontaneously or induced by the antibacterial drugs from drug susceptible strains of M.tuberculosis revealed the resistance to rifampin， isoniazid and ethambutol but no gene mutation of rpoB， katG and embB could be found in the variants. It was considered that the cell wall deficiency was an important resistant mechanism of M.tuberculosis besides the chromosomal gene mutation.
KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis; Cell wall; Gene; Drug resistance
細胞壁缺陷是結核分枝杆菌最常發生的變異現象之一，被認為是結核分枝杆菌生命周期獨特的一個形態時期或相［1］。然而近年的研究［2］發現，結核分枝杆菌不僅可在人工培養基及動物體內自然發生細胞壁缺陷變異，而且也可在利福平、異煙肼和乙胺丁醇等抗結核藥物的誘導下發生細胞壁缺陷變異以及在含高濃度抗結核藥物的培養基內傳代培養。文獻［3］報道，結核分枝杆菌耐藥性的形成主要同其染色體上耐藥性相關基因突變有關，尚未發現質粒等其他細菌所具有的耐藥性機製。為探討細胞壁缺陷導致結核分枝杆菌形成耐藥性的基因機製，本文采用基因檢測與分析的方法，對自發形成和抗結核藥物誘導形成的細胞壁缺陷結核分枝杆菌的耐藥性相關基因進行了檢測與分析，現將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
菌株 16株結核分枝杆菌分別為質控菌1株，中國藥品生物製品檢定所提供，本室編號Mk；臨床分離菌15株，獲自貴陽市肺科醫院住院肺結核患者痰標本，本室編號M1～M15。
培養基 蘇通培養基，按文獻［4］方法製備。
誘導劑 利福平膠囊，批號：國藥準字H21021905，沈陽紅旗製藥有限公司提供；異煙肼片成都錦華藥業有限公司提供，批號H51020788；乙胺丁醇片批號010101，成都錦華藥業有限公司提供。
結核分枝杆菌基因檢測試劑盒 擴增結核分枝杆菌染色體DNA重複保守序列IS986，引物堿基序列為5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3，5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3，擴增產物分子量為245bp。華美生物工程公司提供，批號20050501。
結核分枝杆菌耐藥基因檢測試劑盒
rpoB基因檢測試劑盒 擴增序列涵蓋rpoB基因的第507至533位密碼子，rpoB基因外套引物堿基序列為rpoB P1：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P2：5-AGTGCGACGGGTGCACGT-CGCGGACCT-3，擴增片段215bp；內套引物堿基序列為rpoB P3：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P4：5-GACCTCCAGCCCGGCACG-CTCACCT-3，擴增片段193bp，無錫市克隆遺傳技術研究所提供，批號050613。
katG基因檢測試劑盒 上遊引物5-AGCTCGTATGGCACCGGAAC-3，下遊引物5-TTGACCTCCCACCCGACTTG-3，擴增katG基因904、1523bp，擴增片段為katG基因突變熱點區，包括315、321、381、406、409、418、441、456、463和476位，無錫市遺傳克隆技術研究所提供，批號050613。
embB基因檢測試劑盒 embB基因外套引物的堿基序列為E15-CGGCCTGCATCGTCGCCGGG-3、E2 5-GATCCACAGACTGGCGTCGCTG-3，內套引物E3 5-CGGCATGCGCCGGCTGATTCC-3、E4 5-TCATCAGCGCCAGCAGGTTGTAA-3；E1、E2引物擴增embB基因自7721～8002共282bp堿基序列，E3、E4引物擴增embB自7741～7973共233bp堿基序列，第二次擴增的片段包括embB的突變熱點區，即第285位、306位、和330位共77個密碼子，擴增產物分子量為233bp，無錫市遺傳克隆研究所提供，批號分別為021211、031013、030610、040503。
PCR產物純化試劑盒 Ultra Clean PCR Clean-up Kit，美國MOBIO公司提供。
PCR測序試劑 BigDye Terminator Kit，美國PE公司提供。
1.2 方法
菌種鑒定 用BACTEC-TB460檢測係統以及結核分枝杆菌基因檢測試劑盒推薦的方法，對各菌株分別進行菌種鑒定，染色體IS986序列PCR擴增與檢測，RFP、INH和EMB敏感性測定以及rpoB、katG和embB基因的PCR擴增與序列分析。
穩定L型誘導與分離 根據各菌株的藥物敏感性及其耐藥相關基因檢測結果，選擇rpoB基因未發生突變的Mk、M4、M5菌株和突變的M13菌株，katG基因未發生突變的M15菌株和突變的M5、M8菌株以及embB基因未發生突變的M2、M4、M5、M6、M7、M8菌株。按文獻［2］方法將各菌株分別接種於不含藥物的蘇通培養基，將rpoB未突變菌株接種於含RFP 0.1、0.2、0
穩定L型鑒定 按上述菌種鑒定的方法，分別提取各菌株自發形成和誘導形成的L型的染色體DNA，進行IS986序列PCR擴增與檢測。
穩定L型藥物敏感性檢測 取自發形成及RFP、INH、EMB誘導形成的結核分枝杆菌穩定L型純培養物，分別接種於含不同濃度RFP、INH及EMB的蘇通培養基內，置普通溫箱內
穩定L型耐藥性相關基因檢測 根據結核分枝杆菌rpoB、katG、embB基因檢測試劑盒推薦程序，分別提取自發形成及RFP、INH、EMB誘導形成的穩定L型染色體DNA進行PCR擴增和2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測儀觀察。rpoB、katG、embB基因的PCR擴增產物分別純化後，在自動測序儀上進行序列測定與分析。
2 結果
2.1 結核分枝杆菌的藥物敏感性
Mk、M4、M5對RFP敏感，M13對RFP耐藥；M5、M15對INH敏感，M8對INH耐藥；M2、M4、M5、M6、M7和M8對EMB敏感。各菌株均可檢出IS986序列，耐藥菌株可見相關基因的突變，敏感菌株未見基因突變。
2.2 結核分枝杆菌穩定L型
結核分枝杆菌各菌株在不含藥物的培養基內培養10～14d後可見L型形成。Mk、M4和M5菌株在含RFP為0.1、0.2和
Mk、M4、M5、M8、M13和M15菌株的藥物誘導形成及自發形成的穩定L型染色體DNA經PCR擴增和電泳，可見形成與陽性對照一致的分子量245bp的IS986序列條帶。
培養d14，Mk、M4、M5和M13菌株自發形成及RFP誘導形成的穩定L型在含RFP為1、2和
PCR擴增產物 Mk、M4、M5和M13菌株RFP誘導形成及自發形成的穩定L型rpoB基因nPCR擴增後，瓊脂糖凝膠電泳可見形成與陽性對照一致的分子量193bp條帶；M5、M8和M15菌株自發形成和誘導形成的穩定L型染色體DNA的katG基因PCR擴增產物，可見形成與陽性對照相同的620bp分子量條帶；M2、M4、M5、M6、M7和M8菌株EMB誘導形成及自發形成的穩定L型embB基因nPCR擴增後，瓊脂糖凝膠電泳可見形成與陽性對照一致的分子量233bp條帶。
PCR產物的核苷酸序列 Mk、M4、M5和M13菌株RFP誘導形成及自發形成的穩定L型rpoB基因擴增產物測序結果與細菌型一致；M5、M8和M15自發形成及異煙肼誘導形成的結核分枝杆菌穩定L型的katG基因擴增產物測序結果與其親代細菌型一致；M2、M4、M5、M6、M7和M8菌株EMB誘導M.tuberculosis形成及自發形成的穩定L型embB基因擴增產物測序結果與細菌型的一致，未發現新的突變位點。
3 討論
細胞壁缺陷變異是細菌細胞壁的合成受到抑製或其完整性受到破壞，細胞丟失細胞壁結構或停止細胞壁合成的一種生存逃逸現象。由於細胞壁缺陷細菌在不含誘導劑的環境中常常可重新合成細胞壁而恢複與其親代細菌一致的各種性質，因此認為細胞壁缺陷變異屬於非遺傳性的形態變異［5］。然而近年的研究［6］證實，完全喪失細胞壁的穩定L型常常難以重新合成細胞壁，從而成為可表達某些新的遺傳性狀的穩定L型菌株。本文結果顯示，細胞壁缺陷結核分枝杆菌的細胞體積增大，主要表現為圓球、卵圓及不規則形態。結核分枝杆菌穩定L型在蘇通培養基內能夠以出芽方式繁殖和傳代培養，但生長速度較其親代細菌型明顯緩慢。
細菌的耐藥性變異是細菌最常見的變異現象，細菌耐藥性的形成與轉移對臨床治療可產生嚴重的影響。文獻［5］認為，細菌耐藥性的形成既可以由於抗性基因轉移或突變所致的遺傳性機製，也可以由於細菌代謝活性降低、喪失抗菌藥物作用的靶位以及抗菌藥物不能穿過細菌寄生細胞的膜所致的非遺傳性機製。細胞壁缺陷造成細菌喪失了抗生素作用的靶位，因此可對青黴素等幹擾細胞壁合成的抗菌藥物形成非遺傳性耐藥性。本文結果顯示，不論自發形成還是抗結核藥物誘導形成的結核分枝杆菌穩定L型均表現出相似的利福平、異煙肼和乙胺丁醇耐藥性。采用基因檢測與分析方法證實，這些穩定L型不但仍然保留了與其親代細菌型一致的IS986序列，而且其染色體上耐藥性相關的rpoB、katG、embB基因也沒有發生突變。提示細胞壁缺陷並不對結核分枝杆菌染色體上IS986序列以及耐藥相關基因產生影響，其所導致結核分枝杆菌形成的利福平、異煙肼和乙胺丁醇耐藥性可能與細菌代謝活性以及某些代謝機製改變有關。結核分枝杆菌不但可由於染色體上耐藥相關基因突變而形成遺傳性耐藥性，而且也可由於細胞壁缺陷及其所導致的代謝活性與機製改變而形成非遺傳性耐藥性。
通常認為［5］，細菌在幹擾細胞壁肽聚糖合成或破壞細胞壁結構的抗生素等因素的作用下，可發生細胞壁缺陷和形成L型。但近年的研究［6］證實，細菌也可在自然生長繁殖的過程中以及在幹擾其他代謝環節的因素作用下發生細胞壁缺陷和成為L型。抗結核藥物的作用機製主要是幹擾蛋白質、核酸、糖及脂的代謝，因此認為對進行活躍代謝活動的結核分枝杆菌具有明顯的抑製或殺滅作用。已知利福平的抗菌機理是抑製依賴DNA的RNA多聚酶活性，阻止結核分枝杆菌mRNA的合成；異煙肼能夠抑製分枝菌酸的合成，影響結核分枝杆菌細胞壁的結構；乙胺丁醇可幹擾阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的合成，導致結核分枝杆菌發生細胞壁缺陷。本文結果顯示，結核分枝杆菌不但能夠在常規的蘇通培養基內自發形成L型，而且也可在利福平、異煙肼、乙胺丁醇的作用下迅速形成L型並且獲得耐藥性。提示結核分枝杆菌是容易發生細胞壁缺陷的細菌，其可在許多因素的作用下發生細胞壁缺陷變異和成為L型。L型的產生使結核分枝杆菌迅速形成對利福平、異煙肼、乙胺丁醇的耐藥，這樣不但可導致臨床抗結核藥物治療無效，而且也可導致病原學檢查以及耐藥性基因檢測與分析的漏診或誤診，從而造成結核分枝杆菌在宿主體內潛伏存在和形成結核的潛在帶菌者與傳染源。
