抗生素微生物檢定管碟法在中國藥典中的應用及操作要點
錄入時間:2010-11-18 10:29:10
來源：青島betway必威西汉姆联
抗生素微生物檢定法可分為：（1）稀釋法；（2）比濁法；（3）瓊脂擴散法（管碟法和打孔法）。各國藥典通常采用後兩種方法測定抗生素的效價。
管碟法：利用抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養基內成球麵形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區，抑製了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈。
此法係根據抗生素在一定濃度範圍內，對數劑量與抑菌圈直徑（麵積）呈直線關係而設計，通過檢測抗生素對微生物的抑製作用，比較標準品與供試品產生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。
原理：利用抗生素在固體培養基中的平麵擴散作用，依據量反應平行線原理並采用交叉實驗設計方法，在相同實驗條件下通過比較標準品（已知效價）和供試品兩者對所接種試驗菌產生的抑菌圈（直徑或麵積）大小，來測定供試品效價的一種方法。
管碟法的操作步驟：
1、預試驗：確定最佳的試驗條件：調整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養基等，使抑菌圈的大小符合規定：一劑量法中心點的抑菌圈直徑應在16～17.5mm，二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm，三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在15～18mm。
2、試驗準備：雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養基、緩衝液的準備、半無菌間的紫外消毒等。
3、雙碟的製備：每隻雙碟加底層培養基約20ml，待培養基凝固後，將雙碟放入35～37℃培養箱中，待用。
4、供試品、標準品溶液的製備：估計供試品的效價，根據試驗要求設計供試品、標準品溶液稀釋步驟，平行製備供試品、標準品相關劑量的溶液。
5、菌層的製備：注意菌層培養基溫度；根據預試驗確定加入菌層培養基的菌液量，注意製備菌層的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。
7、雙碟的培養：根據培養溫度的要求在培養箱中進行培養，培養箱中水平碟放的雙碟數以不超過三層為宜。
8、抑菌圈的測量：抑菌圈測量儀的使用，每組試驗雙碟應在相同的測量參數下進行測量。手工測量：遊標卡尺
9、結果的可靠性檢驗及效價測定：抑菌圈測量儀提供計算結果或手工計算結果。
操作要點
第一步一般應製成500或1000單位/毫升的溶液，以後逐步稀釋至供試濃度的溶液，稀釋步驟應為3～4步。
溶解：對於需用乙醇溶解的樣品，由於溶解樣品時所用乙醇量較大，加滅菌水後溶液放熱，因此需充分搖勻後加滅菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室溫後再稀釋至刻度。
標準品溶液與供試品溶液濃度的比值D應控製在±5%以內，以保證兩者濃度的偏差在一定範圍內。
試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應保持菌種及菌液的新鮮。
一般菌種一月轉種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在製備菌懸液前進行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。
試驗菌傳代最好不超過5次，以防止菌種老化變異。芽孢杆菌培養物用滅菌水洗下後，應在65℃加熱30分鍾，使菌體的菌齡一致，用革蘭氏染色，應有芽孢85%以上。
加入菌懸液的體積，一般不少於0.3ml，並且不大於上層培養基體積的2%。如果加入菌懸液的體積過小，則在同次實驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大，造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大，則會使上層培養基變稀，並且因菌懸液的溫度較低，加至培養基中可能造成培養基結塊，影響測定結果。對於加入菌懸液體積的控製，可通過調節菌懸液的濃度來實現。
在製備菌層培養基時，將菌液加入菌層培養基後，立即充分搖勻，但應避免產生氣泡。
加入芽孢懸液時，菌層培養基的溫度為65℃，對非芽孢懸液時，菌層培養基的溫度一般為48～50℃。
放置孵箱培養時排放應不得超過三層，避免因培養溫度不均勻而導致各雙碟中抑菌圈大小不一。
抗生素原料藥：不含輔料的藥物製劑原料，一般其效價以純度（u/mg或?g/mg）表示。檢驗時，可參考該品種的藥品標準純度限度規定或廠方提供的純度估計效價，取樣試驗，如估計效價與實際效價相差較遠時，即測定所得效價超出估計效價的±10%時，則重新估計效價，再做準確測定。
粉針劑：指注射用無菌粉末或凍幹品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓶內，一般測定其純度（u/mg或?g/mg）或整瓶效價。
取裝量差異項下的內容物，稱取適量（50mg以上，根據標示量及平均裝量折算估計效價，並按估計效價及量瓶體積計算取樣量），置量瓶中，加標準中規定的溶劑溶解，稀釋，測定，計算出1mg的效價單位數，再根據平均裝量及標示量計算平均每瓶的百分含量。
水針劑（注射液）：即抗生素的滅菌水溶液，標示量一般按每毫升含效價單位計。
效價測定時，量取平均裝量項下的內容物或5～10支的內容物，混勻，用幹燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭淨，再棄去多餘的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部內壁緩緩流入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結晶析出）的量瓶內，混勻，繼續加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規定的濃度。
素片、薄膜衣片：稱取20片的總量，求出平均片重，研細混勻後，精密稱取適量（約相當於1片的重量或根據標示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標準中規定的溶劑溶解，並稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規定濃度。
注意點：研磨時應注意環境幹燥，可在幹燥操作櫃內操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內含輔料較多，輔料可能漂浮於溶液表麵，稀釋時量取供試溶液應讀取輔料下層的溶液切麵；如沉澱較多，須待其下沉後再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應加以注意。為節約供試品，可與重量差異檢查結合進行。
糖衣片、腸溶片：取標準中規定的片數，置於乳缽中，研細，分次加入規定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉移至瓶口放有小漏鬥的量瓶中，量瓶體積根據供試品標示量、所取片數及抗生素儲備液濃度（一般為1000單位/ml）選定，用規定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進一步稀釋。個別品種標準如同時收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規定薄膜衣片也取整片製備供試溶液。
膠囊劑：取裝量差異項下的內容物，混合均勻，研細，根據平均裝量，精密稱取約相當於1粒膠囊的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置於量瓶中，加規定的溶劑溶解並稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項下的方法進行。
顆粒劑、幹混懸劑：取裝量差異項下的內容物，混勻，根據平均裝量，精密稱取約相當於1袋（包）的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置於量瓶中，加規定的溶劑溶解並稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋製成供試品溶液。測得效價後，再根據裝量差異項下的平均裝量，計算出平均每袋（包）的效價，根據標示量即可算出含量。
軟膏劑、眼膏劑：擦淨軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開封口，置於幹燥器內約1小時，取幹燥的潔淨分液漏鬥，帶手套操作，將膏劑軟管連同內容物在天平上稱重，取出，將內容物擠入分液漏鬥，量約2g，再稱取膏劑軟管的重量，按減重法以前後稱量之差計算分液漏鬥內膏劑供試品的量，以不含過氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質，但基質中的抗生素則應不溶於或幾乎不溶於該有機溶劑中，以避免提取過程中抗生素的損失。按標準中的規定加提取溶劑至分液漏鬥中，振搖，使基質溶解，用規定的緩衝溶液提取抗生素至水相中，用緩衝溶液提取3次，合並3次的提取液，置量瓶中，加緩衝溶液至刻度，依法操作，計算效價。
實驗要點
磷黴素鈉，磷黴素鈣，磷黴素氨丁三醇
主要問題：抑菌圈偏小
解決：
1. pH9.0抗Ⅱ號培養基（pH7.8～8.0）
2. 滴加藥液後，室溫放置1小時後，放入孵箱內培養。
3. 培養時間以24小時為宜，培養時間短，抑菌圈清晰度不好，培養24h後如抑菌圈仍不清晰，應室溫放置一段時間待清晰後再測量。
啤酒酵母菌的培養
主要問題：生長不良
CP2005：抗Ⅴ號瓊脂斜麵及抗Ⅳ瓊脂斜麵
解決：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培養基；2. 32～35℃培養24小時
沙氏培養基
蛋白腖10g 葡萄糖40g
瓊脂13g 水1000ml
調節滅菌後pH5.4～5.8
YPD培養基
蛋白腖10g 葡萄糖40g
酵母粉5g 瓊脂13g
水1000ml
管碟法特點：
優點：基本操作和設計適用於各種抗生素，試驗結果較穩定；樣品用量少，靈敏度高；適合於大批樣品的測定。
缺點:凡具有抗菌活性的物質都會幹擾測定結果；試驗過程長，需第二天才有結果；操作手工化，需熟練人員才能得到較正確的結果；受擴散因素的影響，如培養基原材料的質量，一般瓊脂中的雜質可能影響擴散速度及效價強度
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