培養基影響大腸杆菌產L-天冬酰胺酶的研究

關鍵詞：培養基；L一天冬酰胺酶；大腸杆菌 

 研究發現，L—天冬酰胺是某些癌細胞生長的營養源，但癌細胞自身不能合成L ． 天冬酰胺，因此L一天冬酰胺酶通過對L天冬酰胺的水解作用能有效抑製癌細胞的生長^［1～2］。臨床試驗證明，L一天冬酰胺酶尤其對急 性白血病和惡性淋 巴母細胞腫瘤有效^［3-4］。近年來由於其應用範圍的不斷擴大，采用大腸杆菌發酵生產L ．天冬酰氨酶受到很多學者的重視，培養基的選擇對於上述問題的研究仍具有重要意義，因此本文從培養基成分和添加比例兩方麵對這一問題加以討論。

1 材料與方法  

1、1  菌株

大腸杆菌 ( E．coli  )，由本教研室生物工程中心實驗室提供。

1 、2 培養基

菌種采用基本培養基進行斜麵移種和保藏。發酵培養基按照不同影響因素配製。

1、3 培養條件

在250 mL三角瓶中進行搖瓶培養，裝液量50 mL，搖床轉速300 r／min，培養溫度37℃，發酵時間l6～20h。   

1、4 測定方法

L一天冬酰胺酶活性測定參Nessler 試劑法^［5］。 37℃下，1  min催化L一天冬酰胺水解生成1grnol 氨的酶量為一個酶活力單位。再由生物量得出單位菌體的酶活，即比酶活力 ( U／g )。產氨率 (％)為單位菌體的產氨量。

菌體濃度測定采用分光光度法測定。試劑均為國產分析純。

2 結果與討論

2、1碳源對大腸杆菌產L．天冬酰胺酶的影響

2、1．1碳源種類對大腸杆菌產L．天冬酰胺酶的影響

     相同的培養條件下，分別選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乳糖作為碳源，按1．0％的比例添加到液體基本培養基中，以基本培養基為對照，經發酵產酶後測定其生物量、產氨量和比酶活。

     以蔗糖為碳源時，其比酶活最高，約為322 U／g，產氨量約為2．45ug／mL，生物量較為適中。與對照實驗相比，除了葡萄糖和檸檬酸三鈉作為碳源時所得比酶活減弱外，其他都有所提高分析原因可能是檸檬酸三鈉一般作為某種特定菌種的碳源，生物量增加較多但比酶活不高，因而不是該菌株產酶最適宜的碳源；葡萄糖作為碳源抑製產酶可能與葡萄糖效應有關，葡萄糖的添加不僅改變了培養基的滲透壓使水活度減小，最主要的是葡萄糖的代謝致使發酵後期大量有機酸的積累，降低了pH從而產酶明顯受到抑製。

2.1.2          碳源添加量對大腸杆菌產L-天冬酰胺酶的影響

蔗糖為碳源時，其酶活力最大，但是蔗糖的添加量也會影響到該菌株的產酶能力。據此分別按0.3%、0.5%、0.7%、1%以及1.5%的比例添加蔗糖作為碳源，在其它相同的條件下進行試驗，測定相應的比酶活和產氨率

在0.3%-0.7%範圍內，隨著蔗糖添加量增大，其比酶活也相應地增大，最大值達到332.5U/g。當添加量繼續增大時，其比酶活減小。產氨率也具有相似的趨勢。故選取蔗糖的添加量為0.7%作為碳源的添加比例。

2．2 氮源對大腸杆菌產L一天冬酰胺酶的影響

2．2．1 氮源種類對大腸杆菌產L一天冬酰胺酶的影響以基本培養基中添加量1．0％的蛋白腖為固定氮源，然後分別以添加量0．3％的牛肉膏和酵母膏作為輔助氮源進行比較，以添加量0．7％的蔗糖為碳源，其餘的條件相同進行實驗，測定其相應的參數。結果如表1所示

表1輔助氮源種類對大腸杆菌產L一天冬酰胺酶的影響

Tab．1Effect of adding amount of nitrogen source on the yield of L- asparaginase  

由表 l可看出選擇0．3％牛肉膏+ 1．0％蛋白腖作為該菌株的氮源時，其比酶活為 3l0．86U/g，相對於0．3％ 酵母膏+1．0％蛋白腖作為氮源比酶活提高了約9．4 ％。 分析原因可能是在同等條件之下，牛肉膏中所含有的某些特殊成分比酵母膏更適於菌體的生長，從而為菌體細胞積累L一天冬酰胺酶提供更加豐富的氮源。 

2、2．2 氮源添加量對大腸杆菌產 L 一 天冬酰胺酶的影響

      輔助氮源添加量的大小也會影響到菌株的產酶能力。在其它相同的條件下蛋白腖的添加量不變仍為l％， 改變牛肉膏的添加量，分別為0．2％、 0．3％、 0．4 ％、0．5％、0．6％、0．8％以及 l ％進行實驗。

     由圖3看出，當牛肉膏添加量為0．5％時，該菌株所產L一天冬酰胺酶的比酶活力最高達到345．68U／g，產氨率也達到最高5．12％。因而培養該菌株時選擇0．5％牛肉膏+1．0％蛋白腖作為最適宜的氮源。 

2、3 微量元素對大腸杆菌產L -天冬酰胺酶的影響

2、3．1微量元素種類對大腸杆菌產L一天冬酰胺酶的影響

按添加量均為0．05％分別選用硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅以及碳酸鈣等微量元素添加到培養基中進行實驗，以不添加微量元素作為對照。其它實驗條件相同，

從圖4中可以看出，添加0．05％的硫酸銅和硫酸鋅對大腸杆菌產L．天冬酰胺酶都會有一定的抑製作用，碳酸鈣的加入基本無影響，而硫酸亞鐵的添加對大腸杆菌L．天冬酰胺的產生有促進作用，比酶活最高為 341．92 U／g，相對於對照提高了17．6％。原因在於鐵是微生物細胞內過氧化氫酶、過氧化物酶、細胞色素與細胞氧化酶的組成元素，缺鐵會使機體內的某些代謝活性降低或喪失。大腸杆菌在鐵含量不足的培養基裏培養時，不能合成足夠的甲酸脫氫酶，而使其生長和代謝受到影響。銅和鋅兩種微量元素抑製了酶活，原因可能是作為誘導酶的抑製劑，使得產酶受阻。

2、3．2 硫酸亞鐵添加量對大腸杆菌產 L．天冬酰胺酶的影響  

按照上述實驗結論，以硫酸亞鐵作為微量元素， 添加量分別為0．005％、0．01％、 0．0 2％、0．03％、0．04％、 0．05％，以不添加硫酸亞鐵作為對照，在搖床上進行發酵，取樣測定相應參數.