培養基凝固劑及觸變性培養基

摘要 介紹常用培養基凝固劑瓊脂、 卡拉膠和黃原膠的凝膠性質。將這三種凝膠配伍使用可配製出具有觸變性的培養基 ，用於特殊的微生物檢測。 

關鍵詞 培養基 凝固劑 觸變性 

微生物培養基是專供微生物培養、分離、鑒別、研究和保藏用的混合營養物製品，常見形態

有液態、流態、半固態和固態。液體培養基常用於大規模生產和增菌培養；流體培養基常用於黴菌和厭氧菌的檢查；半固體培養基常用於菌種傳代和保藏，以及貯運標本；固體培養基常用於微生物的分離純化，抗菌藥物的效價試驗，菌和疫苗的製造以及菌種保藏。這幾種培養基的差別主要取決於培養基中凝固劑種類和加量的差^［1］。培養基凝固劑一般並不是微生物的營養成分，隻起固化或粘合的作用^［2］，形成凝膠。常見的凝固劑有瓊脂、卡拉膠、黃原膠、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠和無機矽膠等。

凝膠是膠體質點或高聚物分子相互交聯形成的空間網狀結構，是介於固體與液體之間的一種特殊的物質形態^［3］。凝膠化是指縮聚反應進行到一定程度，反應體係的粘度突然增大，並且出現具有彈性的凝膠的現象。此時，體係包含兩部分：一部分是凝膠 ，不溶於一切溶劑 ；另一部分是溶膠，其分子量較小，被籠罩在凝膠的網絡結構中^［4］。

由於微生物快速檢測的需要，傳統的固體及液體培養基已經不能滿足現代微生物檢測的需求。如檢測油類物質中的微生物，培養基在接種時應為粘度低的溶膠，而在靜止培養時，又需恢複為高粘凝膠，使菌落不易移動，便於觀察與計數，這就需要培養基具有觸變性。國外已商品化生產的有 MicrobMonitor^［2］培養基成品。使用前不需進行培養基的製備和加熱就可直接應用，但國內還沒有類似產品。

1 瓊脂

瓊脂是一種由瓊脂糖和瓊膠質組成的長鏈多糖複合體，是從石花菜、江籬、紫菜等紅藻類植物中提取而製成的。 

在液體培養基中加l0～ 20 g／L的瓊脂 ，加熱融化凝固後可得固體培養基，加5 g／ L的瓊脂可得半固體培養基^［2］ 。

瓊脂溶於 7 5 ℃以上的熱水和甲酰胺，微溶於乙醇胺，不溶於冷水，但能吸水膨脹。瓊脂溶解後，膠液具有一定的粘性，5％ ～10％的瓊脂溶膠具有高粘度。在45℃、p H   4．5～9．0時，膠液的粘度相對穩定，在 pH 6．0～8．0範圍內，膠液粘度與藻齡、離子強度關係不大，但一旦凝膠形成，在溫度不變的條件下，粘度隨時間而增大。瓊脂溶解後，膠液在42 ℃以下會凝固。文獻^［5］報道由不同種類的原料所製取的瓊脂具有不同的凝固溫度，而由相同原料製取的瓊脂，其凝固溫度基本一致。瓊脂的凝膠強度與其濃度和生

產方法有關，韌性與其粘度和原料的種類有關瓊脂的融化溫度與凝固溫度之差即滯後度比一般凝膠大，為40—60℃。pH接近中性時，瓊脂能與大部分多糖膠配伍，與蛋白質混合不發生絮凝，也不明顯沉澱 ( 組胺樹膠除外) 。

瓊脂的流變性變化是瓊脂凝膠化過程的一個重要特征：①高溫時，流變行為與稀溶液中聚合

物的流變行為相似；②當溫度低至凝固點以下時，流變行為與交聯聚合物的流變行為相似；③在溶膠與凝膠的變化過程中，流變性更為複雜；④瓊脂的流變性還受其濃度、分子量以及其它物質(如甘油等)的影響。    

2 卡拉膠

卡拉膠是存在於杉海苦科、蘇裏爾藻科、葉頂藻科和沙藻科的某些紅海藻中的不溶性膠。它溶於60℃以上的熱水，形成粘性透明或輕微乳白色的易流動溶液，45℃以下凝固^［7］，2．0 ％ 一 2．5 ％的凝膠強度與瓊脂1．5 ％ 一2．0 ％濃度時的凝膠強度基本一致^［8］，但不溶於有機溶劑。卡拉膠大分子沒有分支結構，也不具有陰離子特性， 可以形成高粘度溶液。

( 1 )徐誌麗和吳暉^［9］ 研究發現卡拉膠的粘度：①隨分子量的增大而顯著增大；②隨濃度增大呈指數規律增加；③隨溫度升高呈指數規律下降；④在接近中性時基本穩定且最大。

( 2 )卡拉膠溶液的粘度：①隨恒溫時間而降低；②100℃時，下降有急有緩；③隨著轉速增大，溶液粘度緩慢下降，具有剪切稀化的特征；④隨攪拌時間先緩慢上升，80min後又下降^［10］

( 3 )卡拉膠的凝膠強度：①在一定範圍內與濃度呈正線性關係；②溫度上升，凝膠強度下降，但溫度升降過程的變化曲線不同；③在凝膠開始形成的短時間內，凝膠強度隨時間迅速增大，然後相對穩定，十餘小時後又開始下降；④p H< 5．0時，凝膠強度隨p H的增大而增強，p H 5．0—8．5時趨於平衡，pH8．0—9．5時又下降， 而當p H> 9．5時又回升。

( 4 )卡拉膠形成凝膠所需濃度低，透明度高，但存在凝膠脆性大、彈性小、易脫液收縮等問題。這些問題可通過與其它高聚物配伍的方法來解決，國內外學者對此做了大量研究。黃來發等^［11］研究發現槐豆膠和卡拉膠的相互作用使凝膠較強韌、較柔軟，且不易出現脫液收縮的現象。

3 黃原膠

黃原膠是由植物的細菌性病害甘藍黑腐病產生，由β—D一葡萄糖、β—D一甘露糖和 β—D一葡萄糖醛酸三種單糖組成的。它遇水分散、乳化變成穩定的親水性粘稠膠體，膠液呈中性。黃原膠溶液是典型的假塑性流體，添加海藻酸鈉可改善其假塑性程度^［12］。  

Pettitt^［13］的綜述是黃原膠應用的理論基礎。 

( 1 )黃原膠溶液的粘度與溫度和濃度有關：①室溫下低濃度黃原膠溶液的粘度就很高；②室溫下質量分數為0．5％溶液的粘度約為0．4Pa·s ；③質量分數為1％溶液的粘度約為1Pa·s ；④質量分數為2％溶液的粘度約為 3—4 Pa·s ；⑤在90℃以下，溫度變化對黃原膠溶液的粘度影響很小；⑥在90℃以上，溶液中的螺旋網格結構被破壞，但這個過程是熱可逆的。

( 2 )粘度變化與溶液 p H值和其他添加劑的存在也有關：①p H值較高時，二價金屬離子會引起黃原膠膠凝；②多價鹽類也會引起膠凝，高pH值時尤為明顯；③三價金屬離子在中性，甚至酸性條件下都會引起黃原膠膠凝；④添加鼇合劑可防止膠凝作用。

( 3 )黃原膠對多種植物膠具有特異性的凝集反應，凝集反應研究是從半乳甘露聚糖中的洋槐豆膠和瓜爾膠開始的^［14］，進一步研究發現：①黃原膠與糊精、瓜兒豆膠和刺槐豆膠混合時表現出粘度增加的協同效應；②黃原膠還可以與大多數合成的水溶性聚合物 ( 除高濃度的丙烯酸聚合物外)配伍；③阿拉伯膠在中至高濃度範圍內可與黃原膠生成絡合物；④建議黃原膠不要與纖維素衍生物配伍。

4 觸變性培養基的製備

觸變性流體的流變行為與觀測時間有關：①維持恒定的剪切速率所需的剪切應力隨時間而減小^［15］，因為在外剪切力的作用下，體係的粘度隨時間下降；②當剪切作用停止後，粘度隨時間的推移而增高，大多數經過一定的時間，可以恢複到初始粘度值；③觸變性流體流動曲線的上行曲線與下行曲線不重疊，兩條曲線之間形成了一個封閉的梭型觸變環。

前麵已介紹了一些常見凝固劑的凝膠性質和流變性質。瓊脂、卡拉膠和黃原膠都可形成高粘度溶膠：①瓊脂形成凝膠後透明度高、彈性好、保水性好、無毒且不被微生物液化，但成本較高；②卡拉膠具有假塑性，透明度優於瓊脂，原料來源廣泛、成本低，但彈性不及瓊脂好，較脆，凝固點高，滯後度小；③黃原膠也具有假塑性，對於熱解和化學、物理、生物的降解均具有強對抗作用，但其溶液是非觸變性的流體。所以，使用單一的凝固劑並不能得到較理想的觸變性培養基，需要將多種凝膠配伍使用。

將卡拉膠、黃原膠和瓊脂這三種凝膠聯合使用作為培養基支持物，試驗表明：

( 1 )當三種凝膠濃度分別為卡拉膠l3g／L 、黃原膠2g／L和瓊脂2．5g／L時，製取的培養基在振蕩時呈流動性較好的溶膠狀，保持靜止5～30 s 後又可重新稠化，符合觸變性的特性。且培養基具有以下性質：①澄清，透明度較高，顏色較淺，有利於觀察；②水相物質可溶解，油相物質乳化並溶解；③在恒溫箱中培養，可長出離散的菌落；④泌水性不明顯；⑤不易被微生物降解；⑥能承受高溫滅菌。培養基的這些性質使其特別適用於檢測油類物質中的微生物。

( 2 )在適當範圍內等比例增大或減小三種凝膠的濃度可改變膠液的流動性。增大黃原膠的相對濃度，膠液的粘度也會相應增大。當黃原膠 濃度達到4g／L時，膠液的流動性就變得很差。

( 3 )在配製過程中，應注意使這三種凝膠充分溶解。若未完全溶解，則配成的培養基會有顆粒懸浮物。為使凝膠溶解效果較好，可采取以下措施：①所用的凝膠應顆粒細小而均勻，若因放置時間過久而結塊，可用研缽磨細後再使用；②可先將凝膠稱量好後用冷水浸泡數小時，再加熱溶解；③溶解三種凝膠時，最好加熱使膠液沸騰，確保凝膠完全溶解

( 4 )瓊脂可使培養基成腖狀，為了不讓培養基在滅菌後的冷卻過程中結成一整塊，在冷卻的同時用磁攪拌子加以攪拌，則能形成較細膩的假塑性流體。攪拌時，應受力均勻，否則培養基不均勻。

( 5 )注意在冷卻攪拌過程中保證無菌環境，以免染菌。

5   結語

隨著科學技術的發展，相信不久的將來，人們對微生物培養基凝固劑的各種性質以及配伍作用的機理的認識將會越來越透徹，從而使現有的培養基功能更加完善，並配製出更多具有特殊功能的培養基，使培養基凝固劑得到更好應用。      

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