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論沙門氏菌的檢測方法



錄入時間:2010-11-5 10:28:10 來源:食品安全

 

沙門氏菌是食品微生物中致病菌的一種,下麵介紹幾種檢測沙門氏菌的方法。 

1、傳統的培養方法

用於沙門氏菌分析的傳統方法是食物樣品分步增菌,以增加病原的可檢出率,共有如下四步: ( 1 )預增菌,將樣品加到培養基中,溫度37,使那些“致傷”的細菌複蘇及使所有微生物生長。( 2 ) 選擇增菌,使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數量減少,目前選擇性培養基有3種類型:連四硫基鹽肉湯、硒酸鹽胱氨酸肉湯和 RV培養基。( 3 )分離,即選擇性培養物在含一種或多種抑製非沙門氏菌生長製劑的瓊脂平板上劃線培養,然後對平板上肉眼可見的特征性菌落進行確認。並對該菌落分離物進行生化和血清學檢測,以 做出鑒定。

2 以核酸為基礎的方法

所有的細胞都含有DNARNA這樣唯一一類可攜帶信息的大分子,所以用它作為檢測的標靶。 標靶通常是一個特異性核酸序列,它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。探針需要加附適當的標記,此法應用的探針含有放射性同位素標記的傷寒沙門氏菌DNA片段, 其敏感性高,經約48小時的增菌步驟後, 檢測極限可達1 08個細菌/m l 。目前,以核酸雜交為基礎的第二代技術——比色計目前也已發展起來,此法依賴於沙門氏菌核糖體 RNA( rRNA) ——核糖體發育過程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細胞蛋白質合成器的一部分,每個細菌細胞中存在5000 ~ 20000個複製體,而相比之下染色體 DNA複製體僅 2 ~10個。 這種天然富含r RNA標靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能,同時又保持了與放射性同位素方法相當 或更高的敏感性。 

3、以抗體為基礎的檢測方法

利用抗原——抗體反應的特異性,進行細菌的鑒別和血清學定性。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在,使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。廣泛采用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。此法是指以固定在固體基質上的“捕捉”抗體來捕捉目標抗原,經洗滌除去未結合的成分,加入第二種酶標抗體,此者結合在捕捉到的抗原的不同位點上,第二次洗滌後加入酶作用基質,並令其與顏色成分反應,然後用分光光度法即很容易檢測到目標抗原。采用微量滴定板作為固態基質使反應形式標準化,並促成其自動化。

ELISA法檢出沙門氏菌的極限範圍在105-106個細胞/ml,因此,要得出可靠的結果,食物樣品首先必須進行預增菌、選擇性增菌,通常還要在含有D一甘露糖的肉湯( M肉湯) 中進行後增菌,以促進鞭毛發育。標準的ELISA法樣品製備,經40 ~ 48 小時的孵育才能完成。目前國內口岸係統已應用微量板ELISA法對進出口動物產品進行沙門氏菌檢測。該法采用預先包被了沙門氏菌( A- E) 單克隆抗體的微量板,加入經增菌處理的樣品,反應後再加入一定的指示劑, 作用畢後用酶標儀測定OD值來判定結果,微量板ELI SA法樣品製備過程分三步,共耗時24小時。( 1 ) 選用營養肉湯進行預增菌6小時,使“致傷”、冷凍的沙門氏菌複蘇。( 2)使用選擇性培養基RV進行增菌14小時,使沙門氏菌大量繁殖,同時抑製其它雜菌生長。(3) 使用營養肉湯( 蛋白腖水) 進行後增菌4小時,使沙門氏菌的數量大大增加。 

4、快速檢測方法

(1)平板檢測方法。第一階段,在小孔內加入樣品和抗體聯合物,孵育期間,沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種複合物:包被單克隆抗體——沙門氏菌抗原——抗體聯合物。洗滌後,通過每孔加入基質溶液 ( 過氧化脲) 和色素原溶液( 四甲基氨基丙苯) 來顯示上述複合物 :酶催化色素原的氧化,結果產生藍色。加入反應終止液終止催化反應,並使反應混合物酸化,顏色由藍變黃。( 2 ) 卡片檢測法。 此法以單步免疫反應即夾心型免疫色譜反應為基礎。反應固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體——染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條,抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應區上。增菌後,增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內並令其吸收, 如樣品存在沙門氏菌抗原,它們會與偶合物作用,然後依次遷移到膜上,與固定在膜上反應區的抗體結合,在反應窗上呈現一條色帶。最後結果可在 5 ~ 7秒內讀取。 

 

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