亞硫酸鹽還原菌及檢測

一、生物學特性與衛生學意義
    亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杆菌是梭狀芽胞杆菌屬的一群細菌，而不是一個生物學分類單位。多指厭氧芽胞杆菌，代表性菌株是致黑梭狀芽胞杆菌，其他常見的還有產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風梭菌等。此類細菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物，多為有動力的革蘭氏陽性菌，可形成芽胞，厭氧生長。
    厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環境中廣泛存在，通常出現在人和動物的糞便排泄物，廢水和土壤中。與大腸杆菌和其它杆菌不同的是，由於它們的孢子比營養體對物理和化學因子具有更強的抵抗力，所以可以在自然環境中存活很大時間。因而，通常將他們作為長期汙染或間斷汙染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度，因此，它們對判斷是否已達到控製目的非常有用。
    由於此類細菌抵抗力強，即使在經適當加工處理的加工食品中其芽胞仍會存活，條件適宜時又會生長繁殖，造成食品品質降低或腐敗，甚至會引起食物中毒的危險。因此在食品的製備、貯存以及食品加工廠環境衛生控製上頗受重視，作為食品、礦泉水、加工設備衛生、生產環境的衛生狀況的評估指標，正確得到越來越廣泛的應用。
    該類細菌的檢測多用於環境水質和生活飲用水汙染狀況的評估，在九十年代中後期開始在食品衛生領域中有所要求，但多局限於歐洲國家和地區，如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國。到目前為止，該菌一般不被作為食品衛生常規檢測項目和致病菌檢測內容，我國和美國未將該檢測項目列入食品微生物檢測項目和要求中。
    二、檢測方法
    由於此類細菌以形成芽胞、厭氧生長和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征，往往無需作進一步實驗驗證，因此在檢測中將滿足以上三個條件的一群細菌全部認定為厭氧亞硫酸鹽還原菌。
    檢測方法一般包括以下三部分：檢樣在接種前在80-100℃水浴中處理10-15分鍾，以殺滅抵抗力弱的芽胞細菌的營養體，同時刺激芽胞的繁殖；通過選擇性培養如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力，如果有則進一步與培養基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應，使菌落呈現黑色；培養基接種後置於厭氧環境中培養確認厭氧特征。也可在培養基中加入抗生素等抑製劑抑製其它非亞硫酸鹽還原菌的生長。
    下麵詳細介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杆菌的檢驗方法。
    1.培養基和試劑
    1.1 氯化鈉胰蛋白腖稀釋液
    1.2 亞硫酸鐵瓊脂
    1.3 過氧化氫試劑
    2.儀器和設備
    2.1 均質器:用於處理固體樣品
    2.2培養罐（箱）,帶產生厭氧環境的設備或試劑
    2.3 恒溫培養箱:37±1℃或46±1℃
    2.4 振蕩器
    2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度
    2.6 培養皿:直徑為90mm
    2.7 稀釋瓶:容量為500mL和250mL的廣口瓶
    2.8 天平:感量0.1g
    3.抽樣和試樣製備
    3.1 抽樣
    參照SN0330-94規定抽樣
    3.2試樣製備
    無菌操作稱取剪碎後的樣品25g,置於裝有225mL氯化鈉胰蛋白腖稀釋液的廣口瓶中。若檢測亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min熱處理樣品,之後以流水迅速冷卻至室溫後再稱取。充分混勻後據樣品汙染情況做進一步的係列十倍梯度稀釋。
    4.檢驗步驟與計數
    4.1菌落計數法
    適用於檢查未經加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計數>10g(mL)的食品。
    4.1.1接種和培養
    4.1.1.1對每一份試樣，選用適宜的三個連續稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1 mL，一式雙份地接種於每個滅菌的培養皿中。
    4.1.1.2 傾注約15 mL製備好的並於水浴箱保溫至45℃的亞硫酸鐵瓊脂。從製備最初稀釋液結束到傾注培養基於最後一個平皿所用的時間不應超過15min。仔細將接種物和培養基充分混勻，水平放置，使其凝固。
    4.1.1.3待混合物凝固後，在傾注10 mL同樣的培養基於已凝固的培養基上作為隔層以防氧吸附，並防止細菌蔓延生長。
    4.1.1.4 待該隔層凝固後反轉製備好的平板，於37±1℃厭氧培養24-48h。若對培養溫度有特殊要求（如46℃），可依據情況進行培養。
    4.1.2計數
    4.1.2.1亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厭氧培養24h後，計數典型的菌落；若平板上無特征性菌落或菌落較小（<0.5mm），則需繼續培養24h再計數；若48 h後的菌落增大以至相連，則以24 h的計數為準，反之則以48h為準。
    那些僅產生氫（而不是H2S）的厭氧菌生長時也可還原亞硫酸鹽而導致培養基出現彌散的、非典型的普遍變黑，這種現象不應計數。
    4.1.2.2取特征性菌落（不少於5個）移種於皰肉培養基中，37±1℃厭氧培養24-72 h。待出現生長特征（培養液渾濁、產氣、出現異味）後，按5條進行證實試驗。對陽性結果進行計數。
    4.1.2.3讀取帶有10-100個黑色菌落的平皿，結果以相應稀釋度的兩個平板的菌落數平均值乘以相應稀釋倍數來計算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數。結果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數/g(mL)。
    若相應測試試樣的兩個平板上均無特征性菌落，以<10/g(mL)報告
    4.2最近似值（MPN）法
    適用於檢查亞硫酸鹽還原梭菌計數≤10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品。
    4.2.1接種和培養
    4.2.1.1增菌
    選用適宜的三個連續稀釋的樣液，從每個樣液中分別吸取1mL，一式三份地接種於3管裝有皰肉培養基的試管中,接種後上麵覆蓋一層無菌的液體石蠟，37±1℃培養24-72h。待出現生長特征（培養液混濁、產氣、出現異味）後,按5.1條進行鏡檢。反之，則報告陰性。
    4.2.1.2分離培養
    取4.2.1.1增菌培養物1mL置於滅菌的培養皿中，傾注約15mL45℃的亞硫酸鐵瓊脂。仔細將接種物和培養基充分混勻，待其凝固後，再傾注10mL同樣的培養基作為隔層，於37±1℃厭氧培養24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5條加以證實；反之，則報告陰性。
    4.2.2結果計算
    4.2.2.1計數每個稀釋度得到的陽性反應管數。
    4.2.2.2利用MPN表，由陽性管數估算每克（毫升）試樣中亞硫酸鹽還原梭菌最近似值。結果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數/g(mL)。
    5.證實試驗
    5.1形態觀察
    取皰肉培養物塗片，鏡檢，作革蘭氏染色，檢查培養物細菌形態。亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽性杆菌，單個散在，成對、成小鏈狀或並列地聚堆存在。產芽胞時，芽胞呈卵圓形或球形，位於中央、次終端或終端。
    5.2過氧化氫酶試驗
    在潔淨載玻片上滴1滴培養物，再滴加1-2 滴3% 的過氧化氫。
    出現小氣泡說明有過氧化氫酶活性。
    亞硫酸鹽還原梭菌不形成過氧化氫酶。
    附錄：
    A1 氯化鈉胰蛋白腖稀釋液
    將8.5g氯化鈉和1.0g胰蛋白腖溶解於1000 mL蒸餾水中。調節pH至7.2±0.1。分裝225 mL於250 mL廣口瓶中，121℃高壓滅菌15min。
    A2 亞硫酸鐵瓊脂
    胰蛋白腖 15.0g
    大豆蛋白腖 5.0g
    酵母浸膏 5.0g
    偏重亞硫酸鈉 1.0g
    檸檬酸鐵銨 1.0g
    瓊脂 20.0g
    蒸餾水 1000g
    將各成分混勻，加熱溶解，調節pH至7.6±0.1，分裝於500 mL錐形瓶中各250 mL，121℃高壓滅菌15 min。一周內用完。
    A3皰肉培養基
    牛肉浸液 1000 mL
    蛋白腖 30.0g
    酵母浸膏 5.0g
    磷酸二氫鈉 5.0g
    葡萄糖 3.0g
    可溶性澱粉 2.0g
    碎肉渣 適量
    取碎肉渣分裝15mm×150mm試管約2-3cm高，將上述液體培養基分裝至每管內超過肉渣表麵約1 cm。121℃高壓滅菌15 min。
    A4 過氧化氫酶試驗
    挑取培養物一接種環，置於潔淨載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液（臨用時配製）2mL，於半分鍾內觀察發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性。

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