黃連上清丸微生物限度檢查方法學驗證

【關鍵詞】 黃連上清丸 微生物限度檢查方法 驗證

Abstract Objective：To verify the microorganism limited inspecting method of Huanglian Shangqing pill. Method：Plate counting method was used to count. Trail liquid and bacterial liquid， five bacterial liquids，dilute liquid and bacterial liquid，trail liquid were respectively injected into culture medium of trial group，bacterial liquid group，dilution bilingual group，trail liquid control group. Every trail recovery rate was calculated in three independent trails. The control bacteria checking method was verified by observing cultivation of Escherichia coli，coliform and positive staphybococcus aureus under the same environment. Result：The rate of every trail bacteria was higher than 70%，and the rates of five diluted trail bacterias were higher than 70%. Conclusion：The microorganism limited inspecting of Huanglian Shangqing pill can be used.

Key words Huanglian Shangqing pill; microorganism limited inspecting method; verification

黃連上清丸具有散風清熱、瀉火止痛的功效，用於治療風熱上攻、肺胃熱盛所致的頭暈目眩、牙齒疼痛、口舌生瘡等。其療效確切，患者認可，並為中國藥典（2005年版）收載。生產企業為了適應市場需要和方便患者服用，申請將大蜜丸改變為水丸。現根據中國藥典（2005年版）要求，對非規定滅菌製劑及其原料、輔料進行微生物限度檢查，同時進行方法學驗證。為確保檢驗方法的準確性和可靠性，對該品種的微生物限度檢查進行了計數方法的驗證及控製菌檢查方法的驗證，現將結果報道如下。

1 實驗材料

黃連上清丸由山西萬輝製藥有限公司生產,批號為20050708，20050709，20050710。菌種包括枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲黴［CMCC（F）98003］，由北京生物製品檢定所提供［1］。培養基包括營養瓊脂培養基（20050920）、營養肉湯培養基（20050822）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（20060118）、改良馬丁液體培養基（20060215）、改良馬丁瓊脂培養基（20060125），均由北京奧博星生物科技有限責任公司提供。

2 實驗方法

2.1 菌液的製備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養物至10 mL營養肉湯中，35 ℃~37 ℃培養18 h~24 h，取此培養液1 mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，使菌數約為（50~100）cfu/mL。接種白色念珠菌的新鮮培養物至10 mL改良馬丁液體培養基中，23 ℃~28 ℃培養24 h~48 h，取此培養液1 mL加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-5，使菌數約為（50~100）cfu/mL。接種黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，23 ℃~28 ℃培養5 d~7 d，加（3~5）mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黴菌孢子，吸出菌液，取1 mL菌液加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，使菌數約為（50~100）cfu/mL。以上菌液同時各取兩份注入培養基培養。采用平皿計數法計數。結果見表1。

2.2 計數方法的驗證

2.2.1 供試品溶液的製備 取供試品10 g，加入0.9%無菌氯化鈉至100 mL，振搖，使成1∶10的供試液。

2.2.2 黃連上清丸微生物限度檢查回收率測定 進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。試驗組：取供試液1 mL，加入1 mL菌液［（50~100）cfu/mL］，注入培養基。菌液組：分別取菌液1 mL，注入培養基。供試品對照組：取供試液1 mL，注入培養基。稀釋劑對照組：取稀釋劑（0.9%無菌氯化鈉） 1 mL，加入1 mL菌液［（50~100）cfu/mL］，注入培養基。以上各組試驗均同時做兩份培養，且各試驗菌同時進行，采用平皿計數法。

2.3 控製菌檢查方法的驗證［2］

2.3.1 大腸埃希菌［3］

2.3.1.1 供試液的製備 取供試品10 g，加入0.9%無菌氯化鈉至100 mL，振搖均勻，使其成為1∶10的供試液（未經高壓蒸汽滅菌）

2.3.1.2 驗證方法

試驗組：取供試液10 mL，加到膽鹽乳糖培養基100 mL中，作為供試品管。同法重複1份，加入大腸埃希菌76 cfu作為陽性對照管。另取與供試液等量的稀釋劑加到膽鹽乳糖培養基100 mL中作陰性對照管。35 ℃~37 ℃培養18 h~24 h，取上述增菌液0.2 mL，加入5 mL的4-甲基傘形酮葡糖苷培養基（MUG）試管中，置35 ℃~37 ℃培養5 h~24 h，觀察熒光，再加入靛基質試劑觀察結果。

陰性菌對照組：采用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。驗證大腸埃希菌取膽鹽乳糖培養基100 mL，按試驗組同法操作，其中加入金黃色葡萄球菌75 cfu做陰性對照管。35 ℃~37 ℃培養18 h~24 h，取上述增菌液0.2 mL，加入含5 mL的MUG試管中，35 ℃~37 ℃培養5 h~24 h，觀察結果。

2.3.2 大腸菌群

2.3.2.1 供試液的製備 取2.2.1項下的供試液1 mL，加入0.9%無菌氯化鈉9 mL，即為1∶100的供試液，取1∶100的供試液1 mL，加入0.9%無菌氯化鈉9 mL，即為1∶1 000的供試液。

2.3.2.2 驗證方法

試驗組：取10 mL的膽鹽乳糖發酵培養基管3支，分別加入1∶10的供試液1 mL、1∶100的供試液1 mL、1∶1 000的供試液1 mL，作為供試品管。同法重複1份，加入大腸埃希菌76 cfu作陽性對照管。另取與供試液等量的稀釋劑加到10 mL的膽鹽乳糖發酵培養基管中作陰性對照管。35 ℃~37 ℃培養18 h~24 h，觀察結果。

陰性菌對照組：驗證大腸菌群，采用革蘭氏陽性球菌金黃色葡萄球菌，取10 mL的膽鹽乳糖發酵培養基管3支，按試驗組同法操作，其中加入金黃色葡萄球菌75 cfu作陰性對照管。35 ℃~37 ℃培養18 h~24 h，觀察結果。

2.4 統計方法

供試品計數方法的驗證檢查進行3次獨立的平行試驗，並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

控製菌檢查方法的驗證采用與試驗組和陰性菌對照組同法的操作。

3 結 果

3.1 黃連上清丸微生物限度檢查回收率測定

結果見表2。由表可知該供試品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲黴5種試驗菌的回收率均高於70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高於70%。

3.2 大腸埃希菌和大腸菌群控製菌檢查

結果見表3，表4。由表可見控製菌檢查陽性菌生長良好，陰性菌均未檢出。

4 討 論

我們按照中國藥典（2005年版）微生物限度檢查法中常規法檢驗，首先將樣品進行了細菌黴菌數測定，結果細菌數為4000 cfu/g，給方法學驗證帶來不便，故對製備好的供試液進行了高壓蒸汽滅菌後再進行計數方法的驗證。該供試品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲黴5種試驗菌的回收率均高於70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高於70%，故本品無抑菌作用。

按照中國藥典（2005年版）微生物限度檢查法進行控製菌的方法學驗證試驗及檢查。控製菌檢查陽性菌生長良好，說明本品對大腸埃希菌、大腸菌群沒有抑菌作用。陰性菌均未檢出，表明該控製菌檢查方法的專屬性好，可用於控製菌檢查。

通過對本品的微生物限度檢查計數方法的驗證及控製菌檢查方法的驗證，在處方、生產工藝及檢測環境不變的情況下，采用常規法可以進行本品的微生物限度檢查。

【參考文獻】
［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（二部）［M］. 北京:化學工業出版社，2005：93-98.

［2］馬緒榮，蘇德模. 藥品微生物學檢驗手冊［M］. 北京:科學出版社， 2000：89-90.

［3］中國藥品生物製品檢定所. 中國藥品檢驗標準操作規範［M］. 北京：中醫藥科技出版社，2005：335-341.

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