MTT法進行活菌計數的方法學探討

目的：建立一種快速、穩定、靈敏並可反映細菌活性的細菌計數方法。

方法：以大腸杆菌為研究對象,探討MTT法用於細菌計數的可行性及反應時間、測量細菌數量的範圍、MTT的用量、是否加入溶解劑等實驗條件。

結果：細菌數在3. 8×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 範圍內測出的OD值與細菌濃度呈良好的正相關 ,反應時間為20分鍾,MTT 10μl、 20μl 均可,20μl 效果更佳。可不用溶解劑。

結論：MTT比色分析法可用於檢測活菌數量。

關鍵詞 　 MTT比色法;活菌計數;方法學

　　 在微生物學、免疫學以及其他學科的實驗中,常用一定濃度的活菌作為實驗材料,這就涉及到一個活菌計數的問題。微生物學用於細菌計數的常規方法有比濁法、分光光度計測定法、 平板傾注法或平板塗布法等。前兩種操作方法簡單,但隻能測量細菌數量,不能判斷細菌的活性;後兩種雖然測量的是活菌數,但方法繁瑣,重複性較差,所需時間長。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創,其原理是活細胞內的線粒體脫氫酶可將MTT(為一種淡黃色的四甲基偶氮唑鹽)還原成藍紫色甲月替,而且形成的量與活細胞數量成正比關係。此方法具有簡單、快速、靈敏、穩定之特點,克服了常規方法的不足之處。MTT法目前大多用於免疫細胞及其他細胞的活性檢測,未見用於細菌等微生物的活性檢測的報道。本實驗以大腸杆菌為研究對象,對MTT法用於測量活菌數的可行性及實驗條件進行了探討。

1 　 材料和方法

1. 1 　 細菌

將大腸杆菌的標準菌株(埃希氏菌 44664 ,購於中國藥品生物製品鑒定所)培養於肉湯管,放37 ℃恒溫箱孵育18～24小時,用比濁法定量後,倍比稀釋成8種濃度。

1. 2 　試劑

MTT(sigma)溶於pH7. 4   PBS ,濃度 5mg/ml ,過濾除菌,4℃ 冰箱避光保存。二甲基亞碸(DMSO) 。

1. 3 　MTT比色法測定

取不同濃度的大腸杆菌肉湯培養物 ,加入 96 孔平底培養板(美國Nunc) ,每孔100μl ,各做5個複孔 ,按10μl/孔或20μl/孔加入 MTT溶液 ,放37 ℃恒溫箱10分鍾,20分鍾,40 分鍾後取出,加或不加 DMSO ,用全自動酶標儀(Bio - Rad450 型)於波長570nm下測定OD值。

2 　 結果與分析

2. 1 　 測量範圍

甲月替是活細胞代謝的產物 ,由圖1可見,其生成量隨活菌數的增多而增加,細菌數在3.8 ×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 範圍內與OD 值成正相關 ,線性良好 ,其相關係數 r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 2 　MTT的量對結果的影響　　 分別在細菌數相同的孔中加入 MTT(5mg/ ml )10μl 或20μl ,反應後測OD值 ,結果如圖2所示,各孔OD值隨MTT的量增加而有所增加,在測量範圍內 ,細菌數與 OD 值均呈正相關 ,但加入的 MTT 量為20μl 時 ,相關性更好。MTT量為 10μl , r = 0. 9749 , P< 0. 01 ;MTT量為20μl ,  r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 3 　 反應時間對結果的影響

在孔中加入MTT後 ,用肉眼可觀察到濃度高的兩孔(1.2×10⁹/ml 和 6×10⁸/ ml)幾乎立即出現均勻的藍紫色,放37 ℃ 孵箱 10 分鍾後取出 ,發現除前兩孔外,後幾孔無明顯變化 ,繼續放孵箱 20 分鍾、 40分鍾後取出測 OD 值 ,反應 20 分鍾 ,各孔的OD 值已有明顯的梯度變化 ,OD 值與細菌數之間的相關係數 r = 0. 9998 , P < 0. 01 ;反應 40分鍾後 ,測出的 OD 值稍有增加 ,OD 值與細菌數之間的相關係數反而降低( r = 0. 9735) 。實際測定中 ,反應20分鍾即可。

2. 4 　 溶解劑對結果的影響

反應時間終止時 ,肉眼觀察各孔中呈現深淺不同但很均勻的藍紫色 ,倒置顯微鏡(40×)下觀察 ,有大團分布均勻的藍紫色顆粒,加入DMSO後 ,觀察到顆粒變小、變少,但OD 值的測量加入DMSO前後OD值無顯著差異。

3 　 討論

活細胞體內的線粒體脫氫酶將淡黃色的MTT代謝後形成藍紫色的甲月替,該物質在 560～610nm中有一個較寬的最大吸收峰,用酶標儀可對其進行直接測量,其值與活細胞的數量有良好的線性關係。

本實驗對使用酶標儀測定活菌數量的 MTT法進行了探索 ,實驗結果表明: ①細菌濃度在 3. 8×10⁷～1. 2 × 10⁹/ ml時,OD值與活菌數呈良好的正相關。此測定範圍完全可滿足一般檢測的需要。② MTT的量用10μl 或 20μl 均可,但 MTT為 20μl 時 ,OD 值與活菌數間的相關性更好。③ 反應時間為20分鍾時 ,OD值與細菌濃度呈良好的正相關 ,延長反應時間 ,OD 值與細菌濃度間的相關性反而下降。④加入MTT後 ,用肉眼及倒置顯微鏡觀察 ,孔中呈現均勻的藍紫色 ,測 OD 值也表明,加入DMSO 前後,結果沒有顯著差異,提示測量活菌數可不用溶解劑。這點和報道的檢測其他細胞活性的 MTT比色法有所不同,可能與原核細胞和真核細胞代謝特點的差異以及反應時間不同有關 ,有待進一步探討。

綜上所述,我們認為 MTT比色分析法可用於測量活菌數量,較好的實驗條件為每孔加 MTT (5mg/ml ) 20 μl ,37 ℃ 孵育20 分鍾 ,可不加溶解劑,在 570nm波長測定OD 值。此法經濟、簡便、快速、穩定、靈敏度高,且測出的為活菌數量,具有傳統細菌計數法所無法比擬的優點 ,可滿足一般臨床及基礎檢測的需要。

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