厭氧菌的分離和培養

1.1 了解厭氧微生物的生長特性

1.2 觀察厭氧微生物（雙歧杆菌）的形態特征

1.3 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養與計數技術

2 原理

目前培養厭氧微生物的簡便而又有效的技術包括有：厭氧箱培養技術；厭氧罐培養技術；厭氧袋培養技術；亨蓋特厭氧滾管技術。這裏介紹的是亨蓋特厭氧滾管技術。

亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特（Hungate）於1950年首次提出並應用於瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術。以後這項技術又經曆了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趣完善，並逐漸發展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術。而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。

亨蓋特厭樣滾管培養技術不僅可用於有益厭氧菌如雙歧杆菌等的分離、與活菌培養計數，還可以用於有害腐敗菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭狀芽孢杆菌）的分離與鑒定。

3 材料

3.1 樣品

雙歧酸奶（液體）、雙歧杆菌製劑（固體）。

3.2 培養基

改良MRS培養基，PTYG培養基。

3.3 儀器和器具

亨蓋特厭氧滾管裝置一套，厭氧管，厭氧瓶，滾管機，定量加樣器 

4 流程

銅柱除氧→預還原培養基→稀釋用液製備→稀釋樣品→滾管→培養→計數

5 方法

5.1銅柱係統除氧

銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40—400mm，兩段被加工成漏鬥裝，外壁繞有加熱帶，並與變壓器相連來控製電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由於從氣鋼瓶出來的氣體如N₂、CO₂和H₂等通常都含有O₂，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變為黑色。當向氧化狀的銅柱通入H₂時，H₂與CuO中的氧就結合形成H₂O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反複使用，並不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發生器產生。

5.2 預還原培養基及稀釋液的製備

製作預還原培養基及稀釋液時，先將配製好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而後用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5-5ml，稀釋液裝9ml，並插入通N2氣的長針頭以排除O₂。此時可以清楚地看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最後變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然後蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。

5.3 雙歧杆菌樣品不同稀釋度的製備

在無菌條件下準確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品，而後加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其震蕩均勻，製成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液至另一支裝有9ml生理鹽水的試管中，製成10-2稀釋液。按此操作方法依次進行10倍係列稀釋至10-7，製成不同濃度的樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管培養計數。

5.4厭氧滾管培養法

將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養基試管放置於50℃左右的恒溫水浴中，用1ml無菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個稀釋度的稀釋液各0.1ml於融化了的瓊脂培養基試管中，而後將其平放於盛有冰塊的盤中或特製的滾管機上迅速滾動，這樣帶菌的融化培養基在試管內壁立即凝固成一薄層。每個稀釋度重複3次，而後置於37℃（酸奶樣品42℃）恒溫培養箱中培養。一般培養24—48小時後，即可在厭氧管的瓊脂層內或表麵長出肉眼可見的菌落。

5.5 雙歧杆菌活菌（分離）計數

選擇分散均勻，數量在幾十~幾百個菌落的厭氧試管進行活菌計數，即可得出每克或每毫升樣品中含有的雙歧杆菌數量。

5.6 計算

雙歧杆菌的活菌數量cfu/g(ml)樣品=0.1ml滾管計數的實際平均值×10×稀釋倍數

6 結果

6.1 觀察雙歧杆菌形態，描述其形態特征。
 

6.2 計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧杆菌數量，記錄結果。

7 思考

1 比較平板活菌計數和滾管活菌計數的異同？

2 實驗中通過哪些措施和方法保持細菌的厭氧狀態？

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