風疹病毒分離標準程序

目的

根據中華人民共和國國家標準（GB17009-1997）“風疹診斷標準及處理原則”，對風疹病毒分離作必要的細化和補充，規範風疹病毒分離方法。

適用範圍

本操作細則適用於從咽拭子、尿液標本中分離風疹病毒。

操作細則

原理：病毒感染其敏感的靶細胞後，利用宿主細胞的細胞器、酶類及其能量進行病毒核酸複製，引起宿主細胞的形態學改變，出現細胞融合、壞死和脫落。

1、試劑來源

Vero/slam細胞由國家麻疹實驗室提供，使用代次不超過15代。

2、操作步驟

2.1維持液的配製     100ml
      DMEM                                         96mL
      7.5%碳酸氫鈉                              1mL
      胎牛血清                                      2mL
      青鏈黴素（10000U/mL)                  1mL

2.2細胞製備

在生物安全櫃中將生長良好的成片Vero/slam細胞瓶塞拔下，倒去培養液，加4mLEDTA胰酶混合消化液，蓋上瓶塞，當肉眼可見細胞層變成淡白色或顯微鏡下細胞開始圓縮為度，拔去瓶塞，倒去消化液，加入10mL生長液，用吸管沿瓶壁吹打，使細胞充分混勻。按所需細胞濃度加入營養液分裝,10mL/瓶或5mL/瓶，放37℃孵箱內培養。傳代後2～3天，在顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞生長良好，備用。

2.3標本的處理

2.3.1咽拭子標本：低溫凍融三次，凍存於-70℃以下，備用。

2.3.2尿液標本：標本采集後24小時內送達試驗室，離心處理（4℃,2000rpm,20分鍾），棄上清，加入標本保存液1mL，低溫凍融三次，凍存於-70℃以下，備用。

2.4標本的接種

2.4.1將標本融化，無菌吸取0.2－0.5mL（根據細胞瓶大小決定）接種到生長良好的單層vero/slam細胞瓶中，接種前倒去細胞培養液，使待檢樣品均勻地覆蓋在細胞上，置35℃孵箱內吸附1~2小時，吸附期間應輕輕搖動2~3次，以避免細胞麵幹燥。另留1瓶細胞作為陰性對照。每一份標本接種1瓶細胞，並進行正確標記（包括標本編號、接種日期、傳代數）。

2.4.2吸附完畢後，為防止標本對細胞產生毒性反應，棄去標本液，加入細胞維持液，每瓶5mL—10mL（大方瓶10mL/瓶，小方瓶5mL/瓶）。放35℃孵箱內培養。

2.5 結果觀察

2.5.1每天在顯微鏡下觀察方瓶中的細胞病變（CPE），並記錄融合性細胞的產生過程。如果培養基太酸（由橙色變為黃色），需要更換細胞維持液。

2.5.2當出現典型的融合巨細胞病變+++時。將該瓶培養物凍存於-70℃冰箱，備作病毒鑒定之用。

2.5.3如經7天培養未出現細胞病變，則再盲傳1代繼續觀察7天。由於風疹病毒的細胞病變不明顯,連續傳代2次的分離物應進行病毒鑒定後方可報告結果。

2.5.4細胞病變（CPE）的觀察記錄格式為：
      0～25%的細胞出現病變記錄為“+”；
      25%～50%的細胞出現病變記錄為“++”；
      50%～75%的細胞出現病變記錄為“+++”；
      75%～100%的細胞出現病變記錄為“++++”。

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