蘆薈多糖對鴨疫裏默氏杆菌滅活菌苗免疫效果的影響

曹國文¹ 曾代勤¹ 劉俐君² 陳春林¹ 戴榮國¹

（1、重慶市畜牧科學研究院獸醫研究所 榮昌 402460 2、西南大學榮昌校區 ）

摘要：本試驗將蘆薈多糖作為免疫佐劑，製備蘆薈多糖裏默氏杆菌滅活菌苗，接種3日齡雛鴨，首免後10天進行二免，於首免後7d（以後間隔3d）采血分離血清，采用試管凝集反應監測其抗體升長情況，並於首免後16d進行攻毒試驗，比較蘆薈多糖佐劑菌苗與未加佐劑的甲醛滅活菌苗的免疫效果。抗體檢測結果，蘆薈多糖能明顯促進滅活菌苗特異性抗體的產生，尤其是高劑量（10mg/mL）蘆薈多糖組，產生抗體時間明顯早於低劑量（5mg/mL）組和未加蘆薈多糖組，而抗體滴度也明顯高於其它組；空白對照組血清中抗體滴度始終為零；甲醛滅活菌苗組具有一定免疫原性，但產生抗體的時間晚，滴度亦較低。攻毒試驗結果：高劑量蘆薈多糖組保護率為33.3％，而甲醛菌苗保護率僅11.1％，未注射疫苗組攻毒後全部死亡。試驗結果表明，蘆薈多糖佐劑滅活菌苗免疫效果明顯優於未加蘆薈多糖的滅活菌苗，證明蘆薈多糖佐劑能夠增強滅活菌苗的免疫效果。

關鍵詞：鴨疫裏默氏杆菌   蘆薈多糖佐劑   滅活菌苗   免疫效果

鴨疫裏默氏杆菌病又名鴨傳染性漿膜炎（Infectious  serositis  in duckling），該病是由鴨疫裏默氏杆菌（Riemerella  anatipestifer  RA）引起的嚴重危害雛鴨和幼鴨的一種傳染病。自1982年由郭玉璞^[1]首次報道本病以來，全國各省市自治區均相繼有報道。該病無明顯的季節性，一年四季均可發生，感染率可高達90%，死亡率1%～80%不等（高的可達90%以上）耐過鴨生長不良，增重緩慢，失去飼養價值，而且該病在發病場能持續存在，引起不同批次的鴨感染發病，給養鴨業造成嚴重的經濟損失^[2]。RA極易產生耐藥性，在臨床治療上已經難以找到這種細菌敏感的藥物^[3]。由於該菌血清型多且交叉抗原存在較少，截止目前，抗菌藥物和自家菌苗成為治療和預防該病的有效措施^[4.5.6]。中藥作為免疫增強劑報道較多，但用作疫苗佐劑的報道較少，本試驗以中藥蘆薈提取多糖，作為疫苗佐劑添加於鴨疫裏默氏杆菌甲醛滅活菌苗中，進行免疫效果的對比試驗，獲得明顯的免疫增效作用，為尋求新的疫苗佐劑奠定了基礎，現將研究結果報道如下。

1.材料和方法

1.1實驗材料

鴨疫裏氏杆菌菌株：標準Ⅰ型：由南京農業大學中國農業部動物疫病重點診斷實驗室惠贈。野毒株分自重慶市九龍坡區白市驛某養鴨場。

蘆薈多糖：由重慶市畜牧科學研究院獸醫研究所動物藥品研究中心從庫拉索蘆薈中提取，含多糖44％以上。

家兔與3日齡雛鴨：健康家兔與雛鴨，均購自榮昌縣水口寺農貿市場。

1.2主要試劑

營養瓊脂培養基：（北京奧博星生物技術有限責任公司 批號：20041023）。兔血瓊脂培養基：營養瓊脂培養基加5％兔血製成。麥康凱瓊脂培養基：（上海市醫學化驗所試劑廠 批號：930401）。革蘭氏染液、微量生化鑒定管、去離子水、生理鹽水均由重慶市畜牧科學研究院獸醫研究所自製。

1.3 主要儀器設備

生物攝影顯微鏡（BH-2.Olympus）、恒溫培養箱（PYX-YDH-50×6上海市躍進醫療器械一廠）、4℃冰箱（華淩冰箱 BCO-188@HC 廣東廣州市）、-75℃超低溫冰箱（美國Revco ULT1386-3v）、超淨工作台（蚌埠淨化設備廠）、高壓蒸汽滅菌器（上海佳勝實驗設備有限公司）、烘箱（CS101 3型。中華人民共和國重慶試驗設備廠）、離心機（TDL-5.上海安亭科學儀器廠）。各種相關試劑均均購自重慶市醫藥化學試劑公司。

1.4 細菌的分離鑒定

1.4.1 細菌的分離 

無菌取送檢病死雛鴨心血、肝及腦組織接種於鮮血瓊脂平板，於37℃恒溫箱培養24小時，挑取可疑菌落作初步形態學鑒定即染色鏡檢。

1.4.2 培養特性鑒定

 挑取鮮血平板經形態學鑒定的疑似病原菌分別接種於普通瓊脂培養基、改良瓊脂培養基、血清改良瓊脂培養基及鮮血瓊脂培養基和普通肉湯、改良肉湯、15%血清改良肉湯中，固體培養基置37℃恒溫培養箱靜置培養24～48小時，肉湯置振蕩培養箱培養24小時。觀察並記錄。

1.4.3 生化試驗

   挑取形態學和培養特性鑒定為疑似RA的鮮血平板菌落傳代接種於鮮血平板作純化增菌,取純化的菌落無菌接種於微量生化鑒定管,膠布封口,置37℃恒溫培養箱置培養過夜。同時，取純化的菌落接種於血清改良肉湯中置37℃振蕩培養箱培養，用於MR、VP及靛基質試驗。

1.4.4 動物回歸實驗

選取4隻10日齡健康雛鴨，將鮮血平板純化菌落洗下作為攻毒菌液，皮下注射0.5mL/隻（含菌量1×10⁹cfu/mL），觀察並記錄結果。病死鴨剖解，無菌取心血劃線於鮮血平板培養基培養，觀察有否細菌生長及菌落形態特征。

1.5 兩種滅活菌苗的製備

1.5.1 增菌與滅活   取鑒定並純化的RA接種於鮮血平板進行大規模增菌培養，滅菌生理鹽水洗滌。按0.5：100體積比加入甲醛溶液置37℃過夜滅活(每隔4～6小時振搖一次)。取少量滅活菌液以麥氏比濁法測定細菌濃度後備用。

1.5.2 疫苗的製備   用滅菌生理鹽水將菌液稀釋成終濃度為200億/mL。按比例加入蘆薈多糖佐劑，製成含蘆薈多糖（以多糖計）5mg/mL、10mg/mL的兩種佐劑菌苗，振搖15min後備用。

1.5.3 兩種滅活苗無菌及安全性檢驗   取已經製備好的甲醛滅活菌苗及蘆薈多糖佐劑滅活菌苗各1mL，均勻塗布於鮮血平板，37℃恒溫培養箱靜置過夜，觀察有否細菌生長。取18隻非免疫10日齡雛鴨，分成兩組，分別進行安全性測定。每組接種3個免疫劑量梯度，即0.5mL/隻、1mL/隻、2mLl/隻，每個梯度接種3隻鴨，觀察10 d。

1.6 兩種滅活菌苗免疫效果對比試驗

1.6.1免疫接種程序與劑量   按表1進行免疫接種。

表1 兩種菌苗免疫接種程序及劑量

Table 1 the inoculation formality and dosage of the two kinds of bacteria vaccines

備注：1、含蘆薈多糖5mg/mL；2、含蘆薈多糖10mg/mL；3、二免在第一次免疫後的第10天進行。

1.6.2 待檢血清的采取與製備

    免疫後第7d，從每組10隻鴨中隨機選取5隻，用一次性注射器按1mL/次采集頸靜脈血液。以後每隔3d采血一次直至1個月。采集鮮血轉入滅菌5mL離心管（有蓋），37℃溫箱作用30min，後轉入4℃冰箱沉析，取上清液即為待檢血清，4℃冰箱保存備用。

1.6.3 抗體的檢測   采用試管凝集反應^[6]檢測兩種滅活菌苗免疫後的抗體升長情況，比較其兩種菌苗的免疫效果。

1.6.4攻毒試驗  首免後第16d，選擇空白對照組、無佐劑菌苗組和高含量蘆薈多糖菌苗組試驗鴨，以野毒菌株培養物（約6×10⁹CFU/ml）進行攻毒試驗，觀察其發病與死亡情況。

2.結果與分析

2.1鴨疫裏默氏杆菌的分離鑒定：通過對疑似病原菌形態學觀察，該菌呈細小短杆菌，革蘭氏陰性，兩極略濃染，散在或成群分布；菌落呈邊緣整齊的圓形，中央隆突，乳白色或奶油色，鮮血平板菌落呈露滴狀，有熒光反應。該菌不在普通瓊脂培養基、普通肉湯、改良肉湯、改良瓊脂平板生長，能在血清肉湯培養基和血清瓊脂培養基及鮮血平板生長，要求營養條件較高。生化特性鑒別試驗結果，除蔗糖陽性外，半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、H₂S、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素及MR試驗、VP試驗、靛基質試驗均為陰性，與標準菌株一致。動物回歸試驗，被接種疑似鴨疫裏默氏杆菌病原菌的試驗鴨表現出較典型的鴨傳染性漿膜炎症狀，尤其剖檢時肝與心包膜纖維素沉積最為顯著。綜上表明，該送檢病鴨是由鴨疫裏默氏杆菌引起的鴨傳染性漿膜炎。

2.2 通過無菌檢驗和安全性檢驗表明，鴨疫裏默氏杆菌蘆薈多糖佐劑滅活苗與甲醛滅活苗均未受細菌汙染；注射2mL/隻雛鴨不表現毒副反應，表明安全性較好。

2.3 兩種鴨疫裏默氏杆菌滅活菌苗免疫後抗體效價的測定：結果見表2。

表2  兩種滅活菌苗免疫後抗體測定結果

Table 2 the specific antibody response to AR in ducks immunized with the two kinds killed bacteria

備注:1.樣本數是指隨機采取血清樣品的每組試驗鴨數目；2.抗體滴度是以所測5個樣本的平均數；3、采血時間。

盧新華1993^[7]報道，美國1992年將從蘆薈中提取的“甘露聚糖”作為免疫增強劑應用於馬立克疫苗，可增強肉雞的免疫應答。國內陸鋼等（1995）^【8】研究了蘆薈對雛雞IBD攻毒前後免疫器官的影響，證實蘆薈有促進雛雞免疫器官發育和增重的作用，但將其作為滅活菌苗佐劑在國內尚未見報道。本研究以蘆薈多糖作為鴨疫裏默氏杆菌滅活菌苗佐劑，探討蘆薈多糖作為佐劑的免疫原性和增效作用。結果表明，蘆薈多糖能明顯增強疫苗的免疫效果，尤其當蘆薈多糖為10mg/mL時，RA滅活菌苗產生抗體的時間明顯早於5mg/mL劑量滅活菌苗組和未加佐劑菌苗組，且抗體滴度高，維持高滴度的時間較長。未加佐劑的甲醛滅活菌苗具有一定的免疫原性，但產生抗體的時間較晚，滴度較低。

2.4兩種鴨疫裏默氏杆菌滅活菌苗免疫組攻毒試驗結果：首免後第16d，選擇空白對照組、甲醛菌苗組和高含量蘆薈多糖菌苗組試驗鴨，進行攻毒試驗，結果見表3。

表3 兩種菌苗免疫16d後攻毒試驗結果

Table 3 the results of virus attacking test at day 16 post primary immunization of the two bacteria vaccines

表3結果證實，未接種疫苗組鴨全部發病死亡，甲醛菌苗組保護率僅11.1％，而蘆薈多糖菌苗組保護率遠高於甲醛菌苗組，達到33.3％。攻毒試驗保護率不高，原因可能有二：一是攻毒時間可能不合適，由於滅活菌苗產生特異性保護抗體較慢，攻毒時的抗體滴度較低，還不能產生很好的保護作用；二是攻毒用菌量可能過大，加之本菌是新分離的野毒株，致病力較強，用前未做適宜用量的篩選。但從本試驗結果仍可以看出，蘆薈多糖確有增強疫苗免疫效力的作用。

3.結論

本試驗將蘆薈多糖作為免疫佐劑，製備蘆薈多糖鴨疫裏默氏杆菌滅活菌苗，接種3日齡雛鴨（每隻0.5mL）。首免後10天進行二免，於首免後7d（以後間隔3d）采血分離血清，采用試管凝集反應監測其抗體升長情況，並於首免後16d進行攻毒試驗，比較蘆薈多糖佐劑菌苗與未加佐劑的甲醛滅活菌苗的免疫效果。抗體檢測結果，蘆薈多糖能明顯促進滅活菌苗特異性抗體的產生，尤其是高含量（10mg/mL）蘆薈多糖組，產生抗體時間明顯早於低含量（5mg/mL）組和未加蘆薈多糖組，而抗體滴度也明顯高於其它組；甲醛滅活菌苗組具有一定免疫原性，但產生抗體的時間晚，滴度亦較低。攻毒試驗結果：高含量蘆薈多糖組保護率為33.3％，而甲醛菌苗保護率僅11.1％，未注射疫苗組攻毒後全部死亡。試驗結果表明，蘆薈多糖佐劑滅活菌苗免疫效果明顯優於未加蘆薈多糖的滅活菌苗，證明蘆薈多糖佐劑能夠增強滅活菌苗的免疫效果。

4.參考文獻：

[1] 郭玉璞，陳德威，範國雄等.畜牧獸醫學報[J].1982，13（2）：7-13

[2] 鄭騰，李昂，陳枝華.鴨傳染性漿膜炎的診斷和防治現狀及進展.中國家禽[J]，2002，21：40～42

[3] 程安春，汪銘書.最新鴨病診斷與防治[M].成都：四川大學出版社，1995.8.

[4]  Pathanasophon P..New serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thai land[J].Avian Pathol,1995,24:：195～199.

[5] 程安春，汪銘書，陳孝躍等.我國鴨疫裏默氏杆菌血清型的調查及新血清型的發現和病原特性.中國獸醫學報[J]，2003，23（4）：320-323

[6] 張大丙，郭玉璞.我國鴨疫裏氏杆菌血清型的鑒定.畜牧獸醫學報[J]，1999，30(6)：536-542

[7] 盧新華，用蘆薈提取物“甘露聚糖”增強肉雞的免疫應答.國外畜牧學－豬與禽[J]. 1993.（3）：53～54

[8]  陸鋼，邊慶華，劉瑞萍. 蘆薈蜂膠花粉對雛雞IBD攻毒前後免疫器官的影響. 中國獸醫雜[J].1995（21）9：37～40

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