生活汙水（含藥廠廢水）的細菌學檢查

1. 學習水樣的采取方法和水樣中細菌總數測定的方法

2了解水源水的平板菌落計數的原則

3.了解PCR技術監測汙染水體大腸埃希菌的意義和基本原理

4．掌握PCR操作技術

實驗材料：

1．培養基 牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。

2．材料 水樣

3．儀器及其他用具

恒溫培養箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養皿，移液器（1mL），移液管（1mL），試管等，PCR儀，水浴鍋，培養箱，電泳儀，自動微量移液器（各型號），濾膜，PCR管，離心管，Whatman 3MM濾紙或相當產品。

4. 試劑及溶液

含有適當抗菌素的LB培養基，Taq DNA聚合酶，正向引物(20 mmol/L）及反向引物(20mmol/L）溶於水中，DNA分子量標準，乙酸銨（l0mol/L），無水乙醇，    TSEL (50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20%蔗糖，50mmol/L EDTA，1 mg/ml溶菌酶），    SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL蛋白酶K)，    TE緩衝液，l0×擴增緩衝液(500mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，15mmol/L，MgC1₂）。

    4種dNTP貯存液（20mmol/L，pH8.0 )，瓊脂糖溶液(0.7%），電泳緩衝液(1×TAE)，溴化乙錠染色液，6×凝膠上樣緩衝液。

實驗原理：

本實驗采用平板菌落計數技術測定水中細菌總數。由於水中細菌種類繁多，它們對營養和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖。因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌落計算得到的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基測定水中細菌總數。

大腸埃希菌（Escherichia coli )是指示糞便汙染的重要指示物。當水體中出現大量的E. coli就說明近期內水體受到了糞便汙染（因其脫離寄主後，其半存留期會大大縮短）。PCR檢測這種微生物非常靈敏，即使每100mL水中隻有一個個體，也能被檢驗出來。

實驗內容：（一）細菌總數測定

自來水

(1)用滅菌移液管或移液器吸取lmL水樣，注入滅菌培養皿中。

(2)分別傾注約15mL已融化並冷卻到45℃左右的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，並立即在桌上作平麵旋搖，使水樣與培養基充分混勻。

(3)另取一空的滅菌培養皿，傾注牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基15mL，作空白對照。

(4)培養基凝固後，倒置於37℃溫箱中，培養24h，進行菌落計數。兩個平板的平均菌落數即為lmL水樣的細菌總數。

池水、河水或湖水等

(1)稀釋水樣：取3個滅菌空試管，分別加入9mL滅菌水。取lmL水樣注入第一管9mL滅菌水內、搖勻，再自第一管取lmL至下一管滅菌水內，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10^-1，10^-2與10^-3。稀釋倍數看水樣汙染程度而定，以培養後平板的菌落數在30~300個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數均多到無法計數或少到無法計數，則需繼續稀釋或減小稀釋倍數。一般中等汙染水樣，取10^-1，10^-2,10^-3三個連續稀釋度，汙染嚴重的取10^-2，10^-3，10^-4三個連續稀釋度。

(2)自最後三個稀釋度的試管中各取1mL稀釋水加入空的滅菌培養皿中。每一稀釋度做兩個培養皿。

(3)各傾注15mL己融化並冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，立即放在桌上搖勻。

(4)凝固後倒置於37℃培養箱中培養24h.。

菌落計數方法

(1)  先計算相同稀釋度的平均菌落數。若其中一個平板有較大片狀菌苔生長時，則不應采用，而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數。

(2)  選擇平均菌落數在30~300之間的，當隻有一個稀釋度的平均菌落數符合此範圍時，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數。

(3)  若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30~300之間，則按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小於2，應采取兩者的平均數；若大於2，則取其中較小的菌落總數。

(4)  若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數。

(5)  若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數。

(6)  若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，則以近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數。

（二）應用PCR技術監測汙染水體大腸埃希菌

1．水樣的處理及模板DNA的製備

(1)  取水樣lmL，低速(2 000 r/min )離心5min，以除去不溶性雜質。取出上清，經6 000 r/min離心5min，收集菌體。

(2)  將菌體懸於100 mlTSEL溶液中，置37℃水浴作用30 min。

(3)  向反應混合物中加入300ml SSK溶液，置37℃繼續作用60 min。

(4)  向反應混合物中加入2倍體積的無水乙醇，搖勻後置-20℃，2h. 12 000 r/min離心15 min，收集沉澱，室溫晾幹後將沉澱物溶於100~300ml無菌去離子水或TE緩衝液中備用。

如果是純培養的菌落，即將菌落挑入100ml無菌去離子水中，加熱煮沸1min，即可作為PCR模板。

2．引物設計

    本實驗的引物來自E. coli的lac Z和lam B基因。

 lac Z引物1：ZL-1675（5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3'）

 引物2：ZR-2025（5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3'）

lam B引物1：BL-4910(5'-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3'）

引物2：BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3'）

3．PCR擴增體係

    按以下次序，將各成分加在0.5mL PCR薄壁管內混合：

        l0×擴增緩衝液5ml

        20mmo1/L 4種dNTP混合液（pH8.0）1ml

        20mmo1/L正向引物2.5ml

        20mmo1/L反向引物2.5ml

        模板DNA 5~10ml

        Taq DNA聚合酶1~2單位

        補足H₂O至總體積50ml

4．PCR循環

按以下方法進行PCR擴增，典型的程序有變性、複性和聚合（延伸反應）。依擴增產物大小與引物堿基組成來確定時間與溫度。時間與溫度會影響到產物的特異性。具體參數需摸索。

5．擴增產物的檢測和分析

 如果擴增產物大小與其他非特異性DNA片段相差很大，則可直接電泳，通過大小來判斷；如果擴增產物中有特異性限製酶切位點，則酶切後電泳，由其大小來判斷。

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