植物組培中常見汙染及其預防措施

汙染是指在培養過程中，培養基或培養材料上滋生真菌、細菌等微生物，使培養材料不能正常生長和發育的現象。組織培養中汙染是經常發生的，常見的汙染病原是細菌和真菌兩大類。細菌汙染常在接種1-2d後表現，培養基表麵出現黏液狀菌斑。真菌汙染一般在接種後3d以後才表現，主要症狀時培養基上出現絨毛狀菌絲，然後形成不同顏色的孢子層。

造成汙染的原因也很多，主要有

(1)  培養基及各種使用器具滅菌不徹底

(2)  外植體消毒不徹底

(3)  接種時不嚴格無菌操作

(4)  接種和培養環境不清潔

(5)  培養容器原因，包括蓋子和封口膜等。

材料帶菌或培養基滅菌不徹底會造成成批接種材料被細菌汙染，操作人員不嚴格遵守無菌操作規程也是造成細菌汙染的重要原因。培養環境不清潔、超淨工作台的過濾裝置失效、培養容器的口徑過大以及封口膜破損等主要引起真菌汙染。

 

（1）滅菌要徹底

在組培生產中，各種培養基以及接種過程中使用的各種器具都要嚴格滅菌。首先是培養基的滅菌，耐高溫的培養基需要在121-123℃條件下滅菌20-30min。若出現滅菌時間不足或溫度不夠，培養一段時間後就會在培養基表麵產生細菌性的汙染。一些不耐高溫的物質，可采取細菌過濾器除去其中的微生物。其次，接種用的器具除了經過高溫黴菌外，在接種的過程中，每使用1次後，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到汙染物時，極易由於器具引起汙染。第三，對於被汙染的培養瓶和器皿要單獨浸泡，單獨清洗，有條件的滅菌後再清洗。

（2）選擇適當的外植體

要認真地選擇外植體，減少外植體上的帶菌量。一般多年生的木本材料比一二年生的草本材料帶菌多；老的材料比幼嫩的材料帶菌多；田間生長的材料比溫室生長的材料帶菌多；帶泥土的材料比不帶泥土的材料帶菌多。

用莖尖作外植體時，應在室內或無菌條件下對枝條進行預培養。將枝條用水衝洗幹淨後插入無糖的營養液或自來水中，使其發枝。然後以這種新抽的嫩枝作為外植體，可大大減少材料的汙染。或在無菌條件下對才采自田間的枝條進行暗培養，從抽出的徒長黃化枝條上取材，也可明顯地減少汙染。

（3）外植體消毒

外植體上可能附著外生菌和內生菌。外生菌可以通過表麵消毒方法殺滅；而內生菌生長的植物材料內部，表麵消毒難以殺滅，培養一段時間後，病原菌自傷口處滋生。防治內生菌首先將欲取材的植株或枝條放在溫室或無菌培養室內預培養，再在培養液中添加一些抗生素或消毒劑。

（4）環境消毒

不清潔的環境也會使培養的汙染率明顯增加，尤其是在夏季，高溫高濕條件下汙染率更高。接種和培養環境要保持清潔，定期進行熏蒸或噴霧消毒。高錳酸鉀和甲醛熏蒸效果好，但對人體有一定的傷害，一般每年熏蒸2-3次。平時讀接種室和培養室可采用紫外線照射消毒或噴2%來蘇爾消毒。臭氧消毒機對環境消毒效果較好，而且使用靈活方便，對人體的傷害也相對較小。

（5）嚴格無菌操作

在接種時要嚴格無菌操作，避免人為因素造成汙染。為了使超淨工作台有效工作，防止操作區域本身帶菌，要定期讀一過濾器進行清洗和更換。對內部的過濾器，不必經常更換，但每隔一定時間要檢測操作區的帶菌量，如果發現過濾器失敗，則要整塊更換。此外還需要測定操作區的風速，通過調壓旋鈕使操作區的風速達到無菌操作需要的20-30m/min。