1.接種病毒:
①. 一般種毒量按最後所需加入維持液體積的10%,15%或20%來計算,一般10%即可,若希望病變速度快一些,可以加大種毒量,如15%或20%;
②. 如果用小塑料瓶種毒,一般該培養瓶加8-9ml培養液,加入0.8ml病毒即可,病毒加入後,蓋上瓶塞,輕輕將搖晃瓶子,讓病毒液在細胞麵上來回10幾次;
③. 在對照細胞中,加入相同的0.8ml維持液;
2.接種前頭天,進行細胞傳代,細胞數量應以能讓細胞在第二天內達到覆蓋滿90%的培養瓶為準,並且一定要在細胞傳代後48h內接種病毒;
3.第二天細胞長為單層且狀態較好時,開始接種病毒;
4.先移棄培養瓶中的生長液,用1*PBS輕輕洗細胞麵3次,最後用移液管吸幹淨培養瓶中殘留的1*PBS.為保持培養瓶中pH環境的穩定,及減少1*PBS對細胞的刺激作用,可再用生長液輕輕洗細胞麵1次,移棄液體,並用移液管吸幹淨瓶中殘留生長液;
5.應該在細胞狀態最好的時候,進行病毒接種或複蘇;
6.將種毒瓶和對照瓶一起放入37oC,CO2烘箱培養1h,其中每隔15min,需要將種毒瓶和對照瓶拿出,輕輕搖晃瓶子,保證病毒液或維持液能在細胞麵上來回20-30次,使病毒液或維持液能充分接觸細胞;
7.1h後,在晃動瓶子4次後,重新進入無菌間,在培養瓶中加入維持液;
①. 維持液配方一:
MEM 2鸖 3%穀氨酰胺 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調節pH至7.0為準,濃度為6%);
②. 維持液配方二:
MEM 3%穀氨酰胺 1%雙抗 NaHCO3(其用量以調節pH至7.0為準,濃度為6%);
③. 一般還是使用有FBS的維持液,因為對細胞有一定的保護作用;
8.將加完維持液的培養瓶放回37oC,CO2烘箱培養,每天觀察,如果有條件,可以每天拍照,直到有90%的細胞出現CPE後,可以進行收毒;
9.收毒可以用反複凍融方法:即將細胞培養瓶放入-20oC冰箱,凍起來後,直接拿出來等起融化後,使勁搖晃瓶子,讓細胞破裂釋放出病毒顆粒,這樣反複4次,即可達到收毒目的;
10.收毒後的病毒液可以用移液管吸入離心管,在1,000-2,000轉下離心10mins,以此除去細胞碎片,將離心後的上清夜轉移,棄底部沉澱,該上清液即可用於病毒濃縮醇化,或病毒滴度測定,或中和試驗等.
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