新型微生物抗菌除臭菌係的研究與應用（2）

3 微生物抗菌除臭的意義和存在的問題

近年來惡臭汙染會對人體產生不容忽視的危害以及各國對惡臭造成的環境汙染的關注,對惡臭的處理研究也日益活躍。雖然微生物脫臭法的曆史尚短、部分工作還停留在實驗階段，但由於其具有傳統方法不可比擬的優勢性和安全性，發展潛力和應用前景相當廣闊。微生物抗菌除臭技術及微生物抗菌除臭劑在研究與應用中的意義及優勢如下：

（1）純綠色環保性質。由於微生物除臭技術是利用能夠轉化或者降解惡臭物質的特殊微生物的高效吸附、吸收和降解作用對惡臭氣體進行淨化，化惡臭為無臭。不含任何化學藥品，也不含轉基因產品成份，不會造成二次汙染，代表著生物環保產業發展的未來方向。
    （2）處理功效高。運用微生物除臭技術大大增強了其處理汙染的功效，與一般化學方法和生物方法相比較，微生物除臭技術對有機物的降解速度是傳統方法的100倍。汙染物在投放微生物除臭劑，可迅速祛除臭味，淨化水質，降低COD、BOD5、氨、氮等指標。
    （3）適應性更廣。微生物除臭技術特別是混菌微生物除臭劑降低微生物生存條件要求，增強適應性，減少過濾，適應多種溫度和pH值範圍，在低氧環境中也能有效發揮作用。
    （4）更有針對性。微生物除臭技術可廣泛適用於不同領域、不同用途和不同的汙染環境；並可根據具體治理對象的具體情況，專門研發出針對性的、最具效力的配方。
    （5）治理成本最低。微生物除臭技術品具有標本兼治的特點，不用征地建廠或購買龐大設備，綜合治理成本和動態投資成本最低，而治理效果顯著。

（6）化害為益。以前認為不能回收利用汙染物，城市汙水廠的汙泥經微生物除臭製成肥料，如氨和硫酸化合成硫酸銨肥料，其中各種元素可被植物吸收；提高了汙泥中有機碳的利用率；而且脫臭微生物大多是土壤中的有益菌群。
    （7）微生物除臭劑與傳統化學產品比較。每種化學產品都是針對性強的產品，當遇有複雜的其他化學基質時，便會失效；使用化學產品之後，在水體中總有化學殘留物，它可能帶來副作用或新的汙染；使用化學產品可掩蓋臭味，卻不能改變臭味的生成或阻止其散發。微生物除臭技術是利用自然分解和在分解過程中的積極生化作用，不會產生上述問題。

（8）微生物除臭劑與傳統生物淨化劑相比。微生物除臭技術可以極大祛除臭味，使液體狀汙物、有機物質迅速新陳代謝，減小固體物質體積，快速淨化被汙染物質。

微生物脫臭法具有傳統方法所不可比擬的優越性,如處理效率高、無二次汙染、所需的設備簡單、易操作、費用低廉、管理維護方便等,其發展潛力和應用前景是相當廣泛的。但是由於受研究和發展時間的限製,微生物脫臭尚有許多亟待解決的問題,主要有:①適合於特定惡臭有機物降解的微生物菌種篩選和馴化的方法;②惡臭氣體的去除率與工藝參數之間的關係還需要定量化;③裝置與設備的設計製造和施工還需規模化;④對高濃度的惡臭廢氣、複雜的混合氣體處理還有待研究;⑤混菌發酵工藝有待優化。

4 本項目的研究內容

本項目是圍繞上述主題開展了《新型微生物抗菌除臭菌係的研究與應用》的研究，課題下達單位為陝西海浪精細化工有限公司，承擔單位為陝西西安海浪生物研究所、西北農林科技大學和其它相關單位。

通過課題組科研人員大量試驗、技術創新、有效的管理和夜以繼日的辛勤勞動，圓滿地完成了課題規定的任務，取得了如下主要技術成果：

4.1 抗菌除臭菌株的分離篩選研究

自然界中微生物資源極其豐富，土壤、水、大氣、動植物及其腐敗殘骸都是微生物的主要棲居和生長繁殖場所，在這些場所可以尋找有益微生物。隨著微生物學研究工作的不斷深入，新的微生物菌種資源開發和利用的前景十分廣闊。分離微生物新種的具體過程大體可分為采樣、樣品處理、富集培養、分離培養、純化、性能測定和菌種鑒定等步驟。

4.1.1 抗菌除臭菌的采集和分離

本研究從采自秦嶺山區不同地區、不同海拔、不同植被的156個土樣中分離出了3230株微生物。

共采用3種方法進行分離：（1）劃線分離法，即用接種針挑取微生物樣品在固體培養基表麵劃線，適當條件下培養，獲得單菌落；（2）塗布分離法，塗布棒蘸取培養液，或先將少量培養液滴在固體培養基表麵，再用塗布棒再固體培養基表麵塗布均勻；（3）稀釋分離法，獲得純種的幾率較大，該法是將降至60℃左右的固體培養基與一定量的菌懸液混勻後，再澆注成平板以獲得單菌落。

在采集的樣品中，待分離的具有除臭能力的菌株在數量上並占優勢，為提高分離效率，課題組成員以投其所好和取其所抗的原則采用在培養基中投放和添加特殊的養分或抗菌物質對所需菌種進行增殖培養或富集培養，使所需菌種的數量相對增加，使天然樣品中的劣勢菌轉變為人工環境中的優勢菌，如:將樣品按30％的接種量加入新鮮豬糞中，反複富集至豬糞無臭化。以無臭豬糞為起始菌種添加到模擬有機垃圾中進行馴化培養。

通過以上方法，本實驗從采集的樣品中共分離到3230株微生物，進而進行除臭菌的篩選。

4.1.2 除臭菌的篩選

所有的微生物育種工作都離不開菌種篩選,篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟。為了提高篩選效率，本實驗將篩選工作分為初篩和複篩兩步進行。對於初篩，要力求快速、簡便；對於複篩，應該做到精確，測得的數據要能夠反映將來的生產水平。

根據所需菌株的特性，本實驗自製了簡單的初篩培養基：殘菜400g，魚頭、內髒、肉渣100g，水800ml，煮沸30min，過濾，調濾液pH7.0，瓊脂2%。按10%接種量接入所試菌株，分別在5d、10d、15d後用感官法初步判定微生物的除臭效果。初篩工作連續進行幾輪。初篩出具有除臭能力的中溫和耐高溫微生物及其除臭效果結果如表4：

表4 中溫和耐高溫微生物除臭效果

從表4中可見，分離的微生物中除臭能力各異，有效百分比最低的是放線菌，為13.40%，最高的為41.66%，而且，耐高溫或嗜熱的細菌、真菌、放線菌，無論從有效菌株還是從有效百分比都表現出除臭能力低於其各類的中溫微生物，這初步說明在常溫條件下，中溫微生物的除臭能力高於耐高溫微生物，或者表明除臭微生物的優勢菌群可能屬於中溫微生物。進而對初篩實驗中有除臭效果的微生物進行分類編號和複篩實驗。

除臭微生物複篩過程采用官能檢測法和臭氣組分測定法兩種方法相結合。官能檢測法是通過嗅辨人員利用其嗅覺對被檢測物質進行嗅味辨別,然後通過計算得出檢測結果，它包括現場官能檢測法和室內液體稀釋法；液體稀釋法現場取雞糞便樣,在試驗室內經過定量、水溶、過濾、稀釋、嗅辨、數據處理等步驟,得出試驗組和對照組雞糞便惡臭程度，最後分析以確認除臭效果。臭氣組分測定法主要是測定臭氣中主要成分—氨氣和硫化氫的量：用硼酸吸收凱氏法測定氨氣的量，用鋅銨絡鹽吸收比色法測定硫化氫的量。

通過上述兩種複篩試驗方法，我們共篩選出73株具有強除臭能力的菌株，其中細菌、絲狀真菌、放線菌、酵母菌分別為32、13、8、20株。

4.1.2 體外抗菌菌株的篩選

根據微生態學原理,用普通培養基和選擇性培養基相結合的方法,自分離的固有菌群中進行致病微生物抑製試驗,以篩選拮抗菌。試驗具體操作參照西安交通大學醫學院微生物教研室進行的體外抗菌試驗。

試驗采用平板稀釋法和杯碟法,自分離出3230個菌株中初篩拮抗菌株,得出38株對普通大腸杆菌和金黃色葡萄球菌有抑製作用；複篩得出10株對豬源弱毒型大腸杆菌(E.coli,C83917)Ｏ_{9:K103,987P:NM}有抑製作用。

4.2 微生物抗菌除臭菌的初步鑒定

經初步鑒定本試驗分離到的抗菌除臭微生物主要種屬類別如下：

表5  抗菌除臭微生物的種類

本實驗篩選的除臭菌株主要是光合細菌類、醋杆菌類、乳杆菌類、芽孢杆菌類、假單胞菌屬、鏈球菌類、酵母菌、絲狀真菌以及放線菌類，共計12個屬73個種的微生物。現就主要種屬的除臭菌簡介如下：

(1)光合菌群

光合細菌(Photo Synthetic Bacteria 簡稱：PSB)屬細菌中的一類，有紫硫菌、綠硫菌、紫色非硫細菌和綠色非硫細菌。本實驗室分離到的兼性厭氧菌主要是紫色非硫細菌，屬原核生物界，光能異養型原核生物門，紅色光合細菌綱，紅螺菌目(Rhodospirillales)，紅螺菌科(Rhodospirillaceae)，紅假單胞菌屬(Rhoropseudomonas)和紅螺菌屬（Rhodospirillum）。
　　光合菌群(好氣性和嫌氣性)，如光合細菌和藍澡類。光合菌群由自養微生物分離而來，具有化害為利的特殊功能，即可將有害物質轉變成為無害物質，並以植物的分泌物、有機物、有害氣體（硫化氫等）及二氧化碳、氨等為基質，合成糖類、氨基酸類、維生素類、氨素化合物和生理活性物質等，是肥沃土壤和促進動植物生長的主要組成部分。光合菌群的代謝物質可以被植物直接吸收，也可以成為其它有益微生物的營養物質。因此，隨著光合菌群的增殖，其它有益微生物也相應增殖。

(2) 乳酸菌群

乳酸菌（LAB,Lactic acid bacteria）是一類能從可發酵碳水化合物（主要指葡萄糖）產生大量乳酸的細菌的統稱，目前已發現的這一類菌在細菌分類學上至少包括18個屬，主要有：乳酸杆菌屬（Lactobacillus）,雙歧杆菌屬（Bifidobacterium），鏈球菌屬（Streptococcus）等,本實驗主要篩選的主要是乳酸杆菌屬（Lactobacillus），鏈球菌屬（Streptococcus）的若幹個種。

乳酸菌群（嫌氣性）它以攝取光合細菌、酵母菌產生的糖類等物質為基礎，製作乳酸。乳酸具有很強的殺菌能力，能有效抑製有害微生物的活動，以及有機物的急劇腐敗分解。乳酸菌能夠使常態下不易分解的木質素和纖維素等變得容易分解，並且消除未分解有機物產生的種種弊端，在有機物發酵分解上發揮突擊隊的重要作用，它將未腐熟的有機物質轉化成對動植物有效的養份。乳酸菌的另一個重要作用，就是能夠抑製連作障礙產生的致病菌增殖。一般情況下，致病菌如果增加，植物就會衰弱，有害線蟲也會急劇增加。乳酸菌抑製了致病菌的活動，有害線蟲也逐漸消失。

(3) 假單胞菌類

本實驗從土壤中分離到具有很強抗菌除臭能力的一株熒光假單胞杆菌陝西變種（Pseudomonas fluorescens var shanxigensis）。熒光假單胞杆菌廣泛存在於土壤中，是定殖於植物根際的優勢細菌種群。由於此類細菌大量存在於植物根圍，又稱根際細菌（Rhizobacteria）。此類細菌以其分布廣泛、適應能力強、繁殖速度快、易於人工培養、對許多病原菌具有很強的拮抗作用，成為近年來報道最多、最具生防潛力和應用價值的生防菌。                                                                                     
    (4) 酸母菌群

酸母菌群（好氣性）它利用氨基酸、糖類及其它有機物質產生發酵力，產生出促進細胞分裂的活性化物質。酵母菌菌群中對於促進其它的有效微生物（如乳酸菌、放線菌）增殖所需要的基質（食物）的生產提供重要的給養保障。此外，酵母菌生產的單細胞蛋白是動物不可缺少的有效養份。

(5)放線菌群

放線菌（好氣性）是細胞和黴菌的中間形態。它從光合細菌中獲取氨基酸、氨素等作為基質，產生出各種抗生物質，可以直接抑製病原菌。它提前獲取有害黴菌和細菌增殖所需要的基質，從而抑製它們的增殖，並創造出其它有益微生物增殖的生存環境。放線菌和光合細菌組成的混合菌群，其抑菌作用比單一放線菌成倍增加。另外，被放線菌分解的物質容易被動植物吸收，從而增強動植物對各種病害的抵抗性和免疫性。

本研究獲得了一株新的鏈黴菌變種，即委內瑞拉鏈黴菌秦嶺變種，該變種具有很強的抑菌活性。
    (6)醋酸菌群

醋酸杆菌（好氣性）它是氨素合成中具有代表性的微生物。它從光合細菌中攝取糖類固態氮，然後一部分供給植物，另一部分再還給光合細菌，形成好氣性和嫌氣性細菌結構的共生態。

4.3 新型微生物抗菌除臭菌係的發酵工藝研究

微生物抗菌除臭菌係是一種新型複合微生物活性菌群。它由光合菌類、醋酸杆菌類、放線菌類、乳酸菌類、酵母菌類及假單胞菌類六大菌群微生物組成的一個功能群體，如何將上述好氣性微生物和嫌氣性微生物按一定的比例加以混合培養,形成多種多樣的微生物群落，各微生物在其生長過程中產生有用物質及其分泌物形成相互生長的基質和原料，通過相互共生、增殖關係形成一個組成複雜、結構穩定、功能廣泛的具有多種多樣細菌的微生物群落的生物菌群，是一個非常複雜的待解決的問題，其本身的生產工藝更表現出世界性的高科技水平。

混合菌液體擴大化發酵工藝流程：

培養基 → 種子發酵罐 → 生產發酵罐→ 除臭劑發酵產品

原始斜麵→  活化斜麵→ 搖床種子

4.3.1 培養基的選擇

根據所用菌種和發酵目的物的特性，對碳源、氮源、無機鹽、生長因子等營養物以及促進劑、緩衝劑等添加物逐個進行了單因子試驗，了解這些因子對菌體生長和產物特性的影響，綜合了各種因素的相互關係，進行正交試驗，得出如下表6得培養基的成分及配製：

表6　培養基成分

4.3.2 種子發酵

種子擴大培養應根據菌種的生理特性，選擇合適的培養條件來獲得代謝旺盛、數量足夠的種子。優良的種子可以縮短生產周期、穩定產量、提高設備利用率。我們針對所選菌種設計了自己種子製備方案和種子質量控製措施：（1）在將放線菌、酵母菌、醋杆菌接種至三角瓶，搖床培養；搖床轉速180r/min，溫度控製在28℃。（2）光合細菌的培養：將光合細菌接種至半密閉細口玻璃瓶（3L）,室溫，光照（1000Lux）培養,間隙搖動。（3）乳酸菌的培養：將乳酸菌接種至密閉細口玻璃瓶中，28℃下靜止培養。

4.3.3 混合菌株的廣大化培養

根據微生物共生互惠這一特性，在研究單菌培養技術和所選除臭微生物互生現象的基礎上，創建自己新型的微生物抗菌除臭劑菌種及發酵體係。

大罐液體發酵法一般生產工藝流程為：菌種接種掊養→種子罐培養→生產罐培養→排放培養液加入適量載體→除臭產品。此法適於工業化生產，便於無菌操作。

將各菌株的種子發酵液按一定的比例接入混合菌生長的合成培養基中，按照一定的工業發酵流程進行發酵，發酵過程中同時進行監測發酵液中的活菌數以及除臭定性實驗。

4.3.4 混合菌的培養條件研究

在除臭混合菌的培養過程中,為了迅速得到量大,價廉的高活性細胞，必須為之創造一個良好的生存環境，比如：適宜的濕度、pH值、氧氣含量、溫度和營養成分等。為探索培養基各組分及培養條件對發酵質量的影響，本研究在基礎培養基中增減或更換某種因子的種類和數量，找出最佳組合。

4.3.5 應用混合菌工業發酵的最佳流程的選擇

用生物法處理環境中惡臭汙染時,處理係統中高效微生物的數量與分解汙染物的活力是運行中的關鍵問題之一。除培養條件等影響因素外,很大程度上取決於最適宜的發酵工藝流程。

表7　最佳發酵工藝流程的選擇¹⁾

1)細胞濃度為5mg·mL^-1濕菌體,好氧為30℃搖床培養,缺氧為靜止培養

由以上試驗可知：該混合菌群生長的pH和溫度範圍較廣,pH為4～10,最適pH5～7,溫度為15～37℃,最適為30℃.生長碳源以紅糖最優,有機氮優於無機氮.利用混合菌完整細胞對雞糞/豬糞處理效果表明,當細胞濃度達20mg·mL^-1時隻需通氣20min就可將臭氣完全去除.從通氣條件看,好氧和缺氧交替進行有利於處理效果的提高。

4.4 新型微生物抗菌除臭菌係的應用試驗

4.4.1 對生活汙水的除臭

取家庭廚房洗米、洗菜、洗魚等混合汙水，將其放置幾天發出惡臭後，取混合菌液不同濃度的投放量對嗅閾值的不同的汙水進行除臭處理，測定不同濃度菌係菌液的投放量對汙水除臭效果的影響。實驗表明：當液體菌係的投放量為汙水的0.1%時，除臭效果最好；並且用對不同嗅閾值生活汙水除臭處理，結果是當汙水的嗅閾值越高時，除臭的效果越顯著．這被認為是汙水中含有較多的營養物質，使所加菌種的活性較高，進而除臭效果較好。

4.4.2  池塘、湖泊等自然水體臭汙水處理試驗

　　采用在西安某公園池塘中的臭汙水中投加微生物抗菌除臭菌係菌液的方法,係統評價了微生物抗菌除臭菌液對汙水中三類常見汙染物去除率的影響。結果表明:①好氧條件下,微生物抗菌除臭菌係菌液顯著提高汙水CODcr去除率的適宜加入量(Ｖ_菌液/Ｖ_汙水)為5/10000-1/1000,增幅達10%;②微生物抗菌除臭菌係在好氧條件下能顯著或極顯著提高汙水NH₄⁺-N的硝化程度,當除臭劑加入量為5/1000時效果最好,增幅達37.62%;厭氧條件下,當加入量為1/10000-1/1000時,能極顯著增強汙水的反硝化作用,NO₃^--N的去除率約提高14%。③微生物抗菌除臭菌係加入量大於5/1000時,才能顯著提高汙水的除磷能力。由試驗可知：微生物抗菌除臭菌係可以有效地降解汙水的有機物質，降低氮、磷的含量，增加水體的透明度，改善底泥顏色並且有效去除異味。

4.4.3 室內垃圾除臭實驗

於一間密封的房間內放一堆已高度腐爛的產生惡臭的垃圾（主要是生活垃圾），在垃圾周圍設置不同的采集地點進行采樣和噴藥，各測定噴藥前及噴藥後15min惡臭中的NH₃、H₂S濃度。試驗結果表明抗菌微生物除臭菌係對生活垃圾具有明顯的除臭效果，NH₃最高去除率可達82.98%，H₂S的最高去除率可達78.33%。

4.4.4 新型微生物抗菌菌係淨化畜舍空氣效果的實驗

運用噴灑法將除臭菌係按每m³空間往地麵上均勻撒放液體除臭菌係，測定氨和硫化氫的濃度。欄舍內5點采樣，取平均值，重複實驗5次。結果表明,本除臭劑可使雞舍內的氨和硫化氫分別平均降解72.5%和81.8%,舍內空氣氨和硫化氫分別平均降到16.8 mg·m^-3和3.9 mg·m^-3,可明顯降低雞舍內的臭味。研究表明,本除臭菌係是目前淨化畜舍空氣較好的淨化劑。

4.4.5 養殖廠雞舍主要致病性微生物的監測及抗菌試驗

對楊淩、寶雞、高陵等地5家養雞場雞舍空氣主要致病性微生物的汙染情況進行調查的基礎上，應用新型微生物抗菌除臭菌係進行消毒，比較處理前後的主要致病性微生物的變化。結果表明：處理後雞舍空氣中含致病微生物顯著降低。總細菌殺滅率達86%～94%，大腸杆菌殺滅率達88%～99%，葡萄球菌殺滅率達87%～94%，黴菌殺滅率達91%～96%。一般認為雞舍空氣細菌殺滅率達80%以上為良好，我們監測消毒後雞舍空氣含3種主要致病菌的殺滅率達78%～95%，證明抗菌微生物除臭菌係對雞舍空氣中致病菌有較強的殺滅作用，達到預期環境控製目的。同時試驗結果還表明利用抗菌微生物除臭菌係與市售的高效廣譜消毒藥易克林具有同等的抗菌效果。

4.4.6 家用電冰箱抗菌除臭實驗

為了解家用冰箱的細菌與真菌汙染情況，科研人員對56台使用中的冰箱采樣112份進行檢測，觀察冰箱細菌和真菌是否超標。將新型抗菌除臭菌係菌液稀釋成不同濃度按一定的投放量對家用冰箱進行噴灑除臭處理，測定除臭菌液對冰箱臭味的去除能力及不同濃度菌液的除臭菌係對冰箱除臭效果的影響。實驗表明該除臭菌係對冰箱中的臭氣有很好的除臭效果。

4.4.7 微生物抗菌除臭菌係對運動鞋的抑菌除臭試驗

為了測試微生物抗菌除臭菌係對運動鞋的抑菌除臭試驗,在實驗室及現場對該樣品進行了抑菌試驗和皮膚刺激試驗。噴霧法檢測微生物抗菌除臭菌係對運動鞋的抑菌效果試驗;試驗結果表明該微生物抗菌除臭菌係原藥對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌抑菌率分別為93%和95%，將原藥稀釋240倍，對金黃色球菌抑菌率為90.95%；對白色念珠菌抑率90.90%。現場試驗結果表明，用原有益菌群製劑進行噴霧，對鞋內自然汙染菌平均抑菌率為97.06%，皮膚刺激試驗表明該樣品對皮膚無刺激。該產品適用於對鞋襪的抑菌除臭。

綜上所述，本課題在有關部門的大力支持下，經過研究小組成員的多年努力，在經曆許多挫折和失敗後，經過大量的試驗研究，特別是在試驗初期（樣品采集、微生物的分離純化、除臭菌的篩選等方麵），不斷地克服困難，總結經驗，努力進取，才取得了上述研究結果，希望該成果無論在理論上還是在生產實踐中，能在惡臭治理方麵發揮其積極作用，為我國環保事業做出一點貢獻。

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